Diese Publikation basiert auf der Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Grant No.  CHE 1708237.

1. Vorbereitung für die Reinigung
<ol><li>Vorbereitung der zellfreien roh-Extrakt<ol>
<li>Erhalten Sie einen ~ 9-10 g Zelle Pellet von E. Coli (BL21), die die Polyhistidine getaggt Metalloprotein25 in einem 50 mL konische Röhrchen überexprimiert.</li>
		<li>~ 9-10 g Pellet-Zelle für ein Gesamtvolumen ~ 45-50 mL 5 mL pro Gramm Raum temp Lyse/Bind Puffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol bei pH 8) hinzufügen. In regelmäßigen Abständen Vortex Auflösung zu fördern. Wenn das Pellet gefroren war, in ein lauwarmes Wasserbad Auftauen.</li>
		<li>Mit Eis-Wasserbad, chill der Zellsuspension auf ~ 3 ° C in Vorbereitung auf die Zelle Lysis. Hinweis: An dieser Stelle ist die Zelle Lyse durch Beschallung, Korn Mahlen oder eine andere Methode möglich. Korn Mahlen wird hier gezeigt, weil es schnelle, relativ preiswert, und keinen Gehörschutz erfordert.</li>
		<li>Montieren Sie ein 50 mL Korn Mahlen Kammer nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Die Perle Mühle voll, halb, der voll, gekühlt 0,1 mm Glasperlen, die bei-20 ° c gelagert wurde</li>
		<li>Füllen Sie den Rest der Kammer mit der gekühltes Zellsuspension und verwenden Sie 4 ° C Lyse/Bind Puffer, um die Kammer vollständig zu füllen.</li>
		<li>Einem kleinen Spatel zum Drehen der Welle die Rührwerksmühle und mischen die Zellsuspension mit den Perlen.</li>
		<li>Entfernen Sie große Bläschen mit einer pipettieren, und Schrauben Sie den Deckel auf.</li>
		<li>Trocknen Sie die Kammer von Undichtigkeiten.</li>
		<li>Die klare, plastische Jacke ca. 1 Tasse Eis hinzu, Invertieren Sie die gefüllten 50 mL Kammer in das Eis gefüllte Jacke und Schraube geschlossen.</li>
		<li>Sichern Sie die Eis-ummantelten Kammer auf den Motor.</li>
		<li>Schalten Sie die Rührwerksmühle auf motor für 15 Sekunden bei 15.800 u/min, dann 45 Sekunden ruhen lassen. Wiederholen Sie 8 Mal.</li>
		<li>Wenn die 8 Zyklen abgeschlossen sind, Dekantieren der gesamten Zellsuspension Lyse in ein 50 mL oder größeres Rohr für high-Speed Zentrifugation (25.000 x g oder höher) bewertet. Legen Sie ein paar ausgewogene Röhren in Zentrifuge und Spin bei 25.000 x g für 40-45 Minuten bei 4° C, pellet-Zelle Schutt und Glasperlen. Hinweis: Wenn 50 mL oder größere Rohre ausgelegt für high-Speed Zentrifugation nicht verfügbar sind, entfernen Sie die Glasperlen durch Zentrifugieren bei 1000-2000 x g für 2-3 min. in einem 50 mL konische Rohr auf ein kleineres Volumen der Zellsuspension (~ 25 mL) hervorbringen, die in einem kleineren Volum dekantiert werden können e-Rohr für high-Speed Zentrifugation bewertet.</li>
		<li>Bei der Zentrifugation abgeschlossen ist, Dekantieren Sie die klar, gelb, zellfreie, grobe Extrakte in ein sauberes 50 mL konische Röhrchen. Achten Sie darauf, keine Fremdkörper Zelle übertragen.</li>
		<li>Sammeln Sie eine kleine Auswahl der rohen zellfreie Extrakte für die spätere Analyse der Reinigung durch SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der IMAC-Spalte<ol>
<li>Erhalten Sie eine 1,5 x 20 cm-Spalte, ausgestattet mit einem unteren Bett, Harz Partikel, einen Luer Lock Anschluss und eine obere Kappe, die enthält auch ein Luer Lock Fitting zu behalten. Passen Sie die Luer-Lock-Steckdose mit einem Absperrhahn zu steuern.</li>
		<li>Arbeitet an der Tischplatte und sicher montieren Sie die Spalte auf einem Ring Stand.</li>
		<li>Erhalten Sie eine 50 %-Brei aus Nickel-gebundenen Nitriloacetic Säure (Ni-NTA) Harz in 20 % Ethanol, die bei 4 ° c gelagert wurde</li>
		<li>Vorsichtig schwenken die Flasche, um gleichmäßig das Harz wieder auszusetzen.</li>
		<li>Arbeiten bei Raumtemperatur und auf die Benchtop Gebrauch eine abgestufte pipettieren, 2 mL des BREIS, zurückzuziehen, die 1 mL Ausbeute wird abgerechnet, Harz binden 50-60 mg Polyhistidine Protein hat, und die Gülle in die Spalte zu übertragen.</li>
		<li>Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die überschüssige Speicherlösung durch die Schwerkraft aus dem Harz abtropfen lassen.</li>
		<li>Schließen Sie den Absperrhahn fest</li>
		<li>Ein Pasteur Pipettieren mit gekühlten Lyse/Bind Puffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol bei pH 8) vorsichtig hinzugeben und in der Spalte der Harz – mindestens 30 mL. Achten Sie darauf, nicht die Harzoberfläche stören. Führen Sie den Puffer, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden.</li>
		<li>Equilibrate des Harzes dadurch, dass des Lyse/Bind-Puffers, langsam aus der Spalte durch die Schwerkraft in eine Sammlung Becherglas abgießen.</li>
		<li>Wenn die Lyse/Bind Puffer meist leer ist, schließen Sie den Absperrhahn um den Fluss des Puffers zu stoppen, wenn ~ 5 mL Lyse-Puffer über den Harz bleibt und lassen Sie die Spalte, aufrecht, bis bereit zu gehen oder für bis zu 1 Woche montiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Reinigung der Polyhistidine-markierte Ziel von IMAC
<ol><li>Waschpuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 8) und Elution Buffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 10 % Glycerin pH 8) vorbereiten. Entspannen Sie bei 4° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Ni-NTA-Spalte für den Zusatz von Rohöl zellfreie Extrakte indem Sie den Absperrhahn öffnen und verbleibende Lyse/Bindung Puffer durch die Schwerkraft durch das Ni-NTA-Harz abtropfen lassen. Wenn der Puffer geleert hat, und die Harzoberfläche ausgesetzt ist, schließen Sie den Absperrhahn.</li>
	<li>Mit einer Pasteur pipettieren, sorgfältig pipettieren extrahiert die Zelle frei Rohöl auf dem Harz, kümmert sich nicht um die Oberfläche zu stören. Führen Sie die grobe Extrakte, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden. Das Volumen der groben Extrakte angewendet ist abhängig von der Höhe der Expression des Proteins Polyhistidine-Tags; Stellen Sie sicher, das Gesamtvolumen der groben Extrakte enthält 50-60 mg oder weniger des Zielproteins pro mL Ni-NTA-Harz (siehe Punkt 1.2.4).</li>
	<li>Wenn alle der groben Extrakte auf die Spalte übertragen wurden, der Absperrhahn geöffnet, sodass die Spalte durch die Schwerkraft abfließen kann. Diese Strömung durch besteht aus Proteinen, die nicht an das Harz – sammle 100 μL für die spätere Analyse der Reinigung durch SDS-PAGE gebunden. 26
</li>
	<li>Die Viskosität der rohen zellfreie Extrakte kann die Schwerkraft fließen der Spalte erheblich verlangsamen. Um die Rate von Strömung zu erhöhen, gelten Sie eine einfache "Handpumpe":<ol>
<li>Nehmen Sie eine Spritze 10 mL Luer-Lock und schließen Sie es an die Kappe von der Spalte, die über ein kurzes Stück Kunststoffschlauch und Luer-Lock-Armaturen zwischen der Spalte GAP und die Spritze. Ziehen Sie den Spritzenkolben, und dann passen Sie die Spalte Kappe an der Oberseite der Spalte fest.</li>
		<li>Komprimieren Sie sanft den Kolben der Spritze während manuell Beurteilung des Durchfluss durch das Sammeln der Eluent in einem Messzylinder; Preise von 1-2 mL pro Minute sind kompatibel mit dem Harz und dieses Setup. Kompression des Spritzenkolbens zunehmender sanft die Fließgeschwindigkeit verlangsamt.</li>
		<li>Um zu verhindern das Eindringen von Luft in den Harz, entfernen Sie die Spalte Kappe Handpumpe befestigt, wenn der Meniskus der angewandten Flüssigkeit 5-10 mm oberhalb des Harzbettes erreicht und ermöglichen das restliche Volumen durch die Schwerkraft ablaufen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn freie Rohöl zellextrakte, Entleeren beendet haben und die Harzoberfläche wieder ausgesetzt ist, verwenden Sie einen Pasteur pipettieren sorgfältig ~ 30 mL gekühlten Waschpuffer hinzufügen der Spalte – kümmert sich nicht um die Oberfläche des Harzes zu stören. Führen Sie den Puffer, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden.</li>
	<li>Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie Waschpuffer durch die Säule abtropfen. Dieser Prozess ist schwach gebundenen Proteine aus dem Harz entfernen. Das Laufmittel zu verwerfen.</li>
	<li>Während die Waschpuffer abläßt, bereiten sechzehn, beschriftet, Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln von 1 mL Fraktionen.</li>
	<li>Wenn die Waschpuffer abgelassen wurde und die Harzoberfläche wieder ausgesetzt ist, schließen Sie den Absperrhahn. Verwenden Sie ein Pasteur pipettieren sorgfältig ~ 30 mL gekühlten Elution Puffer hinzufügen der Spalte – kümmert sich nicht um die Oberfläche des Harzes zu stören. Führen Sie den Puffer, die Mauern der Spalte um Spritzer zu vermeiden.</li>
	<li>Öffnen Sie den Hahn langsam und ermöglichen des Elution Puffers, Polyhistidine tagged Proteins aus der Spalte zu eluieren. Sammeln Sie 1 mL Eluent in jedem markierten Mikrozentrifugenröhrchen, 1 bis 16.</li>
	<li>Testen Sie die Brüche für Protein mit einer kolorimetrischen Protein Assay wie der Bradford-Test oder UV-VIS Spektroskopie nach bestimmten Methoden durch das Reagenz und/oder Instrument Hersteller27,28. Wie hier dargestellt, ist die kolorimetrischen Probe mit Coomassie blau 100 μL Volumen verkleinert um nur eine kleine Menge von einzelnen Fraktionen zu opfern.</li>
	<li>Mix 3 μL der einzelnen Fraktionen mit 100 µL einer kolorimetrischen Protein assay Reagenz und manuell die Bildung einer beliebigen Farbe an das Vorhandensein von Protein in der Fraktion zu beobachten; Erkennung mit einem Spektrometer ist nicht notwendig.</li>
	<li>Wenn Protein im Bruch 16 gefunden wird, weiter eluierenden 1 mL Fraktionen und Assay für Protein in regelmäßigen Abständen, bis der eluierten Brüche nicht mehr eine erhebliche Menge an Protein enthalten.</li>
	<li>Kombinieren Sie proteinhaltigen Fraktionen in einer sauberen konischem Rohr und abheben Sie eine 100 μl Probe für eine spätere Analyse durch SDS-PAGE26.</li>
	<li>Rekonstitution der Metall-Ionen Cofaktor fortsetzen Sie oder frieren Sie des Proteins in 3 mL Aliquote bei-80 ° C ein. Stellen Sie sicher, dass 10 % Glycerin ist enthalten in der Elution Puffer ist ein kryoprotektivum, reine Protein beim Gefrieren zu stabilisieren.</li>
	<li>Wenn Elution der Ni-NTA Spalte abgeschlossen ist, d. h. das Protein ist aus der Spalte und gesammelt in Sekundenbruchteilen, passieren eine weitere 25 mL Elution Puffer durch die Säule, und speichern die Spalte bei 4 ° C in ~ 5 mL Elution Buffer für kurzfristige Lagerung , oder Lyse/Bind Puffer mit 20 % Ethanol für die längerfristige Lagerung.</li>
</ol>3. Wiederherstellung des Zielproteins mit Fe2 +
<ol><li>Zugabe von Fe2 + Hinweis: Eine nicht-Häm-Eisen (II) binden Enzym, wie die l-DOPA-Dioxygenase in diesem Beispiel benötigt ein Fe2 + Ion für Aktivität; aber das Eisen (II) oxidiert leicht zu Eisen (III), die nicht aktiv ist, und ein Bruchteil des Proteins reinigt ohne Eisen überhaupt.<ol>
<li>Um die Wiederherstellung des Metalls zu beginnen, erhalten Sie 3 mL des gereinigten Enzyms in Elution Puffer suspendiert. Wenn gefroren, tauen Sie schnell mit einem lauwarmen Wasserbad, und einmal aufgetaut, das Protein auf Eis gelegt.</li>
		<li>Verwenden das Volumen des Proteins in der Röhre, berechnen Sie die Menge von Natrium Ascorbat (198.1 g/Mol) notwendig, um die Endkonzentration 12,5 mM in der Probe. Außerdem berechnen Sie die Höhe der Dithiothreitol (DTT, 154.25 g/Mol) notwendig, um die Endkonzentration 12,5 mM in der Probe.</li>
		<li>Fügen Sie die solide Natrium Ascorbat und DVB-t und mischen Sie sanft, aber gründlich, um vollständig auflösen. Achten Sie darauf, nicht Proteinfällung mit übermäßig aggressive mischen verursachen. Fügen Sie eine kleine Menge von Eisen (II) Sulfat Heptahydrat (MW 278.01 g/Mol) der Protein-Probe.</li>
		<li>Erlangung Kleinmenge am Salz, Eisen-Hahn ein paar 1 mm Granulat von FeSO4•7H2O solide, auf einem Blatt Papier wiegen, Falten Sie das Papier über das Untermodul "und mit der flachen Seite einer Metall Spachtel zerdrücken.</li>
		<li>Fügen Sie eine Prise Pulver am Rohr des Proteins.</li>
		<li>Vortex mischen und eine rosige rosa Farbe erscheint in der Röhre.</li>
		<li>Inkubieren Sie die rosa Lösung des Proteins begrenzt, für 10-30 Minuten auf dem Eis. Die rosa Farbe wird langsam im Laufe der Zeit verblassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel-filtration<ol>
<li>Verwenden Sie eine Gel Filtration Spalte verpackt mit 10 mL der sphärischen Polyacrylamid-Gel mit einem Molekulargewicht Ausgrenzung Limit von ca. 6.000 und vielfältige hydratisiert Partikel Größe von 90 bis 180 µm in einer Spalte 1,5 x 12 cm, die auch mit einem 10 mL Reservoir ausgestattet ist. Stellen Sie sicher die Spalte ist ausgestattet mit untere und obere Bett unterstützt in Form von 30 Umm porösem Polyethylen Platten das Harz in der Spalte zu behalten und verhindern das Harzbett vor Trockenlauf. Montieren Sie die Gel Filtration Spalte zu einem Ring Stand.</li>
		<li>Wenn eine vorkonfigurierte Gel Filtration Spalte verwenden, entfernen Sie die Kappe und giesst den überschüssigen Puffer oberhalb der oberen Bett-Unterstützung.</li>
		<li>Um die Spalte equilibrate, zunächst füllen das Reservoir mit Puffer mit nachfolgenden Assay und -Speicherung, z. B. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin bei pH 8.0 kompatibel.</li>
		<li>Wenn eine vorkonfigurierte Gel Filtration Spalte verwenden, Abknicken der unteren Spitze des Gel-Filtration-Spalte, starten Sie den Fluss der Puffer und setzen das Luer Slip Fitting. Passt ein Absperrhahn Luer Slip Ende der Spalte, aber offen und ermöglichen die Spalte durch die Schwerkraft zu Tropfen.</li>
		<li>Wenn der Puffer aus der Spalte abgelassen hat und die obere Bett Unterstützung ausgesetzt ist, schließen Sie den Absperrhahn, und die ~ 3 mL Fe (II) rekonstituiert Metalloenzyme in die Spalte durch pipettieren die Lösung auf die freiliegenden oberen Bett.</li>
		<li>Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die gesamte 3,0 mL Probe geben Sie die Spalte durch die Schwerkraft. Entsorgen Sie diese ersten 3 mL Eluent. Eine rosa Farbe, die beim Umgang mit der Lösung bildet wird am oberen Rand der Spalte gefangen werden.</li>
		<li>Wenn die Spalte nicht tropft mehr und die obere Bett Unterstützung ausgesetzt ist, die Spalte mit fügen Sie 4 mL des Puffers Gel-Filtration (z.B. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin bei pH 8,0 hinzu). Öffnen Sie den Absperrhahn und sammeln Sie der Eluent in Mikrozentrifugenröhrchen auf acht 0,5 mL-Fraktionen.</li>
		<li>Testen Sie die Brüche für Protein mit einer kolorimetrischen Protein Assay oder UV-Vis27,28 , wie oben beschrieben.</li>
		<li>Protein-haltigen Brüche zu kombinieren.</li>
		<li>Eine Beispiel für SDS-PAGE-Analyse26zurückzuziehen.</li>
		<li>Fahren Sie mit Test oder Lagerung der Probe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Während die Zugabe von Polyhistidine-Tags, um rekombinante Proteine und ihre Reinigung von IMAC in der biochemischen Literatur3,4,5, Anwendungen der IMAC zu Enzym Reinigung praktisch allgegenwärtig geworden ist in der Biochemie Labor Lehre bleiben spärlich, und veröffentlichte Methoden halten nicht immer die begrenzten Ressourcen des Unterrichts Labor20. Darüber hinaus ist die Verwendung des IMAC in der Lehre-Labor am effektivsten, wenn Experimente gekoppelt, die Aktivität und Reinheit, machen IMAC Reinigung eines Enzyms eine ideale Lehr Aktivität zu bewerten. Um die Anwendung der IMAC auf die Reinigung von Enzymen, einschließlich mechanistische, im Labor Lehre zu verlängern sind zuverlässige und kostengünstige Methoden notwendig. Wir zeigen in diesem Protokoll Benchtop IMAC mit leicht zugängliche und kostengünstige Laborbedarf, womit Sie auch die Einschränkungen bei der Anwendung der IMAC Metalloproteine22durch Neuaufbau von Eisen(II) Metalloenzyme, l-DOPA-Dioxygenase, post-Reinigung. Mit den Reagenzien und Materialien beschrieben, schätzen wir die Kosten für Verbrauchsmaterialien für acht Studentengruppen zwischen 500-600 $ pro Semester dieses Protokoll, einschließlich der in Abbildung 1 und Abbildung 2beschriebenen Analyseschritte ausführen.
Wegen der Leichtigkeit, mit der Fe2 + von Aminosäure-Liganden24 und die einfache Oxidation von Fe2 + O2 , Fe3 +, Rekonstitution von nicht-Häm, distanzieren können, ist Aminosäure chelated Eisen(II) in einem rekombinanten metalloenzyme eine typische Komponente der Enzym-Reinigung. Wenn klassische Chromatographie verwendet wird, ist es möglich, Totalverlust des Eisens in einigen Fällen32zu vermeiden, aber immer öfter das Eisen (II) ist zurück im Beisein von Reduktionsmitteln33,34,35, hinzugefügt 36 oft unter einer anaeroben Atmosphäre37,38,39, und in einigen Fällen das überschüssige Eisen ist nicht entfernt33,34,36, erschwert alle nachfolgenden Assay. Aufeinanderfolgende Stufen von klassischen Chromatographie und eine anaerobe Atmosphäre sind nicht realistisch für das Grundstudium Labor, woraufhin die Entwicklung dieses Protokolls.
Während die manuelle Vorbereitung der Ni-NTA-Spalte und der Verarbeitung von Proben weitgehend durch die Schwerkraft nimmt zusätzliche Zeit und Mühe im Vergleich zu abgepackten Spalten und Chromatographie Instrumentierung automatisierte, ermöglichen die manuelle Schritte zum Anfassen Lernen von den Studierenden, die zu erhöhten Verständnis der Wissenschaft hinter den Prozess führen. Die Zugabe von einem Eisensalz (II) unter den hier aufgeführten Bedingungen reagiert besonders empfindlich auf überschüssige Dithiothreitol. Wenn ein Schüler versehentlich ein Übermaß an Dithiothreitol hinzufügt, dürfte ein Niederschlag-Ereignis. Wir haben festgestellt, dass es hilfreich sein, müssen Studenten auf Berechnungen des Reagenz Mengen vor der Ankunft im Labor, so dass Labor Zeit am effektivsten bei der Bank eingesetzt werden kann. Die gesamte Benchtop IMAC Reinigung - von Zelle-Lyse zu Protein Elution - kann in einem 4-Stunden-Labor, gefolgt von Rekonstitution und Assay in zeitlich nachfolgende Labor erfolgen.

Die ersten Berichte über die Reinigung eines Polyhistidine tagged Proteins aus Extrakten von einen Wirtsorganismus Chelat von Histidin-Tag von einem immobilisierten Metall mit die Literatur in 19881,2eingetragen. Seit dieser Zeit sind die Zugabe von Polyhistidine-Tags, um rekombinante Proteine und ihre Reinigung von immobilisierten Metall Affinitätschromatographie (IMAC) praktisch allgegenwärtig in der biochemischen Literatur3,4geworden, 5. IMAC Reinigungsverfahren können auf die Benchtop mit automatisierten Chromatographie und Spin-Spalte Formate umgesetzt werden. Während Affinität Reinigungsmethoden, vor allem IMAC im Forschungslabor weit verbreitet sind, sind sie weniger häufig im Labor grundständige Lehre. Die am weitesten verbreitete Labor Lehrbücher für Biochemie Labor Lehren nicht routinemäßig dieser Methoden, sondern entscheiden sich für traditionellere Ionenaustausch oder Farbstoff-Bindung Chromatographie6,7,8 , 9. Z. B. die Reinigung von Laktat-Dehydrogenase durch Anderson10 verwendet Affinität von Farbstoff-Bindung, und die Reinigung des bovinen Milch α-Lactalbumin7,11 von Boyer verwendet eine Nickel-Nitriloacetic Säure-Matrix, aber keine rekombinante Poly-Histidin-Tag, verlässt sich stattdessen auf intrinsische Affinität des Proteins für das Harz. Einige moderne Bachelor Labor Lehrbücher und Publikationen setzen immobilisierten Metall Affinitätschromatographie auf Poly-Histidin getaggt Protein-Targets wie grün oder rot fluoreszierende Proteine12,13, 14,15, Antikörper16und ausgewählte Enzyme17,18,19,20, sogar einige unbekannte Funktion21. Wohl ist die Reinigung eines Enzyms im Labor Lehre vorzuziehen, da das Ziel für Aktivität in nachfolgenden Sitzungen untersucht werden kann, bereichern die Erfahrung der "Wissenschaft" seitens der Schülers; in der Tat, diese Art von Labor Erfahrungen veröffentlicht wurden und vorteilhafte Ergebnisse auf Lernerfolge berichtet17,18,20,21. Und doch, Anwendungen der IMAC, Enzym-Reinigung in der Biochemie Labor bleiben spärlich, und die veröffentlichten Methoden können sogar davon ausgehen Zugang zu Chromatographie-Instrumentierung, die in der Regel nicht verfügbar für Unterricht im Klassenzimmer Labor 20. es gibt auch Einschränkungen bei der Anwendung der IMAC zu Metalloproteine, insbesondere diejenigen, die Redox-Sensitive zweiwertige Metallen zu binden, die wesentlich für Aktivität22. Häufig, die Metall-Ionen verloren geht oder oxidiert während der Reinigung ein inaktiven Enzyms ungeeignet zum Bachelor Labor nachgeben.
Eine vollständige ein Drittel der Enzyme binden ein Metallion23, und trotz nahezu universelle Voraussetzung für Eisen in allen Formen des Lebens23, Eisen ist wohl unter den problematischsten Metallionen in Enzymologie. Nicht-Häm-Fe2 + Bindung Enzyme sind besonders anfällig für Verlust und/oder Oxidation des Metalls während der IMAC; vermutlich aufgrund des Fehlens eines engagierten organischen Liganden wie Häm und die Leichtigkeit, mit welcher, die FE2 + von Aminosäure-Liganden24distanzieren können. Ferner ist die Sauerstoff-abhängige Oxidation von Fe2 + zu Fe3 + spontan in wässriger Lösung, durch die negative freie Energie-Änderung und die relative Stabilität von Fe3 +. Oft sind diese Herausforderungen durch Verwendung von anaeroben Atmosphäre und/oder nicht-IMAC Chromatographische Methoden22. In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung von Benchtop IMAC die Fe2 + abhängige Metalloenzyme l-DOPA-Dioxygenase mit einfachen und kostengünstigen Chromatographie Zubehör, gefolgt von der Wiederherstellung der aktiven Seite Fe2 +, zu reinigen und enzymatische Assays. Diese Methoden sind standard in unserem eigenen Bachelor Biochemie Labor von 6-12 Studentengruppen und können verwendet werden, um das Repertoire der Enzym-Untersuchungen auf der Bachelor-Ebene zu erweitern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie (IMAC), Polyhistidine getaggt Proteine ist leicht von Studenten beherrschen und ist die am weitesten verbreitete Protein-Reinigung-Methode in der modernen Literatur geworden. Aber die Anwendung der Affinitätschromatographie auf Metall-bindende Proteine, insbesondere solche mit Redox empfindliche Metalle wie Eisen, beschränkt sich oft auf Labors mit Zugang zu einem Handschuhfach - Ausrüstung, die nicht routinemäßig in die undergraduate Labor. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen unsere Benchtop Methoden zur Isolierung, IMAC Reinigung und Metall-Ionen Rekonstitution von einem Poly-Histidin getaggt, Redox-aktiven, nicht-Häm-Eisen-bindende Extradiol Dioxygenase und die Dioxygenase mit abwechslungsreichen Untergrund-assay Konzentrationen und Sauerstoff zu sättigen. Diese Methoden werden ausgeführt durch Studierende und grundständige Lehre und Forschung Labor mit Instrumentierung, die leicht zugängliche und erschwingliche vor allem undergraduate Institutionen umgesetzt.

Diese repräsentative Ergebnisse wurden von Studenten gesammelt, wie sie dieses Protokoll zu Zeiten zwei Kurs Labor BCM 341 ausgeführt: experimentelle Biochemie am Muhlenberg College. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Reinigung eine 20 kDa Poly-Histidin getaggt Metalloenzyme, l-DOPA-Dioxygenase, gespielt von zwei Studenten in einem Labor Zeitraum 4 Stunden Unterricht und durch die gleichen von SDS-PAGE analysiert Studenten während einer anschließenden Labor-Periode. Poly-Histidin-tagged Proteins ist effektiv gereinigt (Abbildung 1, Spur 2). Ein Immunoblot des Gels mit Antikörper gegen das Poly-Histidin-Tag weist darauf hin, dass eine kleine Menge des Zielproteins Poly-Histidin markiert im Durchflussverfahren (Daten nicht gezeigt), verloren geht wahrscheinlich weil die größer als 100 mg Menge des Zielproteins in der lysate überschritten die Bindungskapazität des Harzes.
Abbildung 2 zeigt Schüler gesammelt Aktivitätsdaten auf der enzymatischen Reaktion von Poly-Histidin tagged Metalloenzyme Ziel, l-DOPA-Dioxygenase, nach der Rekonstitution mit Eisen (II) und anschließende Gel-Filtration wie beschrieben durch das Protokoll Hierin. Die fünf Sekunden Totzeit bevor Daten beginnt ist typisch für Studenten, die diese Technik zum ersten Mal ausführen. Die robuste Aktivität der Metalloenzyme wurde erkannt, mit einer veröffentlichten Assay und stationären kinetische Parameter mit veröffentlichten Ergebnisse29in Einklang gebracht. Steady State kinetische Parameter wurden durch den Einbau der Fortschritt Kurven30 in Abbildung 2dargestellte bestimmt; nichtlineare kleinste Quadrate Montage der ersten Sätze gesammelt über eine Reihe von Substrat-Konzentrationen ist jedoch ebenso möglich31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Abbildung 1: SDS-PAGE26 Analyse von Poly-Histidin getaggt Protein vor, während und nach der Reinigung. Bahnen 1 - Molekulargewicht Marker, 2 gereinigtes Protein (20 kDa) Post Ni-NTA, 3-Ni-NTA Durchströmung, 4 - kostenlose Rohöl zellextrakte vor der Reinigung, 5 - zellenrückstand Pellet Post Lyse. Proben wurden mit 5 x Probenbeladung/Puffer zubereitet und auf vorgegossenen 4-20 % Polyacrylamid-Gele mit einem Gel-Elektrophorese System getrennt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Abbildung 2. Steady-State-Test von Eisen (II) rekonstituiert Metalloenzyme (z.B. l-DOPA-Dioxygenase, 10µM) mit Substrat (l-DOPA-5 µM (rot), 25 µM (grün), 50 µM (blau)) im Puffer (50 mM Phosphat, 200 mM NaCl, pH 8). Spuren zeigen Produktbildung am 414nm. Extinktion Daten wurden kontinuierlich erworben, mit 1 mL Methacrylat Küvetten in einem Split-Beam Scan UV-VIS-Spektrometer29. RAW-Daten sind für ein Modell der Michaelis-Menten stationären Annäherung (KM 30,8 µM ± 14,4, kKatzeoffensichtlich 2.3 s-1 ± 0,05)30geeignet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Tischplatte immobilisiert Metall Affinität Chromatographie Reinigung und anschließende Wiederherstellung der ein Polyhistidine markiert, nicht-Häm-Eisen bindende Dioxygenase für grundständige Lehre Labor geeignet.

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.1K Aufrufe.  Muhlenberg College. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Tischplatte immobilisiert Metall Affinität Chromatographie Reinigung und anschließende Wiederherstellung der ein Polyhistidine markiert, nicht-Häm-Eisen bindende Dioxygenase für grundständige Lehre Labor geeignet.

Serie: Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known small molecule-protein interactions and to find potential protein targets for natural products. Compared with other methods, DARTS uses native, unmodified, small molecules and is simple and easy to operate. In this study, we further enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The protein-ligand interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used the mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case for establishment of our protocol. From the proteolytic curve we saw that the proteolysis of mTOR by pronase was inhibited by the presence of rapamycin. The dose-dependency curve allowed us to estimate the binding affinity of rapamycin and mTOR. This method is likely to be a powerful and simple method for accurately identifying novel target proteins and for the optimization of drug target engagement.

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

In this study, we enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case.

Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...