Yazarlar çalışma tasarım ilk onun katkısı için Heather Currey ve Dr. Swarup Mitra el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Michael B. Harris Yorumlar, iyileştirme ve bu metodoloji gösteri üreten yardım için teşekkür etmek istiyorum. Suşları araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu yayında bildirilen araştırma tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaraları UL1GM118991, TL4GM118992 veya RL5GM118990 altında ve bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir)'tarafından desteklenmiştir Ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant sayı 5P20GM103395-15 altında. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. UA bir AA/EO işveren ve eğitim kurumu ve herhangi bir bireysel karşı yasadışı ayrımcılık yasaklar: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis elek İnşaat ve kullanım
<ol><li>
İnşaat iletişim kuralı
	<ol>
<li>2 kapaklar 50 mL konik tüpler (Şekil 1A) dan elde etmek.</li>
		<li>Çıkarmak belgili tanımlık merkezi alan (alttan Şekil 1Bgörüntülendiğinde) kapaklarının iç dudak içinde Bunsen brülör ve bir sıcak metal sonda veya bir havya kullanarak veya drill bit bastı. Not: daha az yaralanma riski olduğundan ve plastik kapak kesmek için ısı kullanarak bir bıçak için tercih edilir.</li>
		<li>Temiz ve kesilmiş kenarları kum ve kavisli bir dosya veya bir rotary Aracı (Örneğin, Dremel) zımpara ile yüzey top. Şekil 1 cbakın.</li>
		<li>Monofilament ağ çemberi uygun çap (Şekil 1 d) kesti. Bunun için bir fırça kılı naylon mesh levha üzerine bir kapak izleme ve çizilen çizginin içine kesti.</li>
		<li>Oluklar/eğik çizgi (Şekil 1E) plastik tutkal uygulandığında iki kapakları yapışma geliştirmek için kapakları üst yüzeyine oyulmuş.</li>
		<li>Etanol kapaklı temiz ve kuru bırakın.</li>
		<li>Cyanoacrylate tutkal dış kenarına tutmak her iki kapaklarında, üst yüzeyine uygulamak. Not: biraz tutkal uzun bir yol gidiyor.</li>
		<li>Monofilament ağ, Tablo 1göre bir yapıştırılmış kapak (Şekil 1F) yattı. Yer üstünde tepe-in kafes ters ikinci kapak; Her iki kapakları üst kısımları birlikte olması gerekir. Basın sıkıca birlikte (Şekil 1G). Mesh gergin olduğundan emin olun. Not: kullanım cımbız mesh kapakları yerleştirmek için bir güvenlik önlemi olarak.</li>
		<li>İlk katman tutkal kuruduktan sonra bir yüzük cyanoacrylate tutkal kapakları arasındaki dış boşluğu çevresinde geçerli. Bu bütünlük ekler ve apart ya da sızıntı herhangi bir peeling engeller gibi cömert olun.</li>
		<li>Filtre monofilament kafes kafes gözenek büyüklüğü ile etiketleyin. Not: Burada, iki kafes gözenek boyutunu kullan — 20 µm ve 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İletişim kuralı kullanın
	<ol>
<li>Elek önceden ıslak.<ol>
<li>M9 gibi tuzlu bir çözüm pipette [NaCl, 6 g Na2HPO4, KH2PO4, 1 ultrasaf H2O L ve 1 mL MgSO4 (1 M) 3 g, 5 g]17, elek bir damlacık oluşturur kadar merkezi aracılığıyla , yoğunlaşarak ve damlar filtre alt (Şekil 2A) Merkezi kapalı. İsteğe bağlı olarak, şeklin altına hav bırakmayan mendil (Örneğin, Kimwipe) uygulamak veya nem damlacık mesh üzerinde yayılmış.</li>
			<li>Elek 50 mL konik tüp yerleştirin. Tüp 'Atık tüp' olarak etiketleyin (Şekil 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>C. elegans nüfusu bir agar plaka kapalı yıkayın.<ol>
<li>M9 arabellek Tabağını yıka ve solucan içeren orta monofilament kafes 1 mL topside vasıl a zaman (Şekil 2C) yerleştirin. Mesh Merkezi'nde çalışmaya emin olun. Tüm solucanlar plaka yıkayın. Not: Genellikle, M9 3 mL 60 mm plaka için yeterlidir.</li>
			<li>Pipetting içinde kayıp solucanlar sayısını en aza indirmek için bir cam Pasteur pipet solucanlar plaka kapalı ve kafes Merkezi (gerektiği gibi tekrar) üzerine taşımak için kullanın.</li>
			<li>M9 arabellek üstten filtresiyle durulayın. Yine, mesh merkezinde çalışan ve o bölgede tüm solucanlar durulama emin olun. Tüm bakteri ve daha küçük solucanlar kafes geçti emin olmak gerektiği gibi birçok kez yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elek boyutu eşlemeli hayvanlardan hasat.<ol>
<li>Elek, Yetişkin solucanlar adım 1.2.2.3 yeni koleksiyon tüp (Şekil 2B) içine bakan ile üst yeni 50 mL konik tüp takın.</li>
			<li>İlk tüp (atık tüp) kaldırmak ve hızlı bir şekilde geçiş--dan damlacığı tutmak için yeni tüp ve elek üzerine çevirmek (Şekil 2E). Not: kısırlık gerekli değilse, hav bırakmayan bir silme (Örneğin, Kimwipe) fitil sıvısı için saygısız önce kafes altından kullanın.</li>
			<li>M9 ile kafes içine yeni 50 mL tüp yeni topside (Şekil 2F) sizden durulayın. Yine, kafes ortasında kullanımı ve bir damlacık mesh alt bakımı.</li>
			<li>Solucanlar yerleşmek veya yavaşça onları aşağı spin izin (Örneğin, < 16 x g) yaklaşık 1 dk (Şekil 2 g) için.</li>
			<li>Solucanlar, Pelet arabellek çözümden ideal aşağı Aspire edin > 0.5 mL, veya pelet bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın.</li>
			<li>Bir cam Pasteur pipet NGM plaka üzerine kullanarak solucanlar pipette ve koyup kuruyuncaya kadar bırakın. Onlar daha hızlı (Şekil 2 H) Kuru böylece birden çok damlacıkları dışarı yeni bir tabağa uzay.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elek temiz.<ol>
<li>Elek yavaşça ve iyice etanol ve ters osmoz su ile durulayın. Kurumasını bekleyin.</li>
			<li>Belirsiz gelecekte kullanmak için temiz bir kapta saklayın.</li>
			<li>Zaman mesh "sag" görünümünü geliştirir atmak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sıralama yöntemi Caenorhabditis elek doğrulama
<ol><li>Genel bakım
	<ol>
<li>Tüm deneyler için kültür solucanlar üzerinde standart bir yuvarlak solucanlar büyüme medya17 (1 litre NGM oluşur pepton, 17 g agar, NaCl, 3 g çift distile su, 5 mg/mL kolesterol, 1 M CaCl2 1 mL 1 mL 975 mL 2.5 gram 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4ve 100 mg/mL streptomisin 0.5 mL) 25 ° C'de</li>
	</ol></li>
	<li>Deneysel bir tedavi yönetimi
	<ol>
<li>Üç tedavi grupları karşılaştırın: çekme, fluorodeoxyuridine (FUDR) ve Caenorhabditis elek.<ol>
<li>FUDR tedavi grubu için herhangi bir döl önlemek için 100 mikron son bir konsantrasyon NGM medyaya 100 mg/mL FUDR eklemek ve solucanlar her geçen gün gıda tükenmesi önlemek için bir taze NGM tabağa aktarın.</li>
			<li>Seçim grubu için seçmek ve platin bir döngü kullanarak el ile solucanlar aktarmak.</li>
			<li>Caenorhabditis elek tedavi grubu için izlemek adım 1.2 ve solucanlar bir NGM plaka üzerine pipette.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Elek yüzde verim
	<ol>
<li>Ne kadar etkili elek C. eleganssıralama yönü olduğunu ölçmek için gün 1 25 ° c (yani, yumurta döşeme sonra 48 h) erişkin yaş zaman uyumlu N2 hayvanlar büyümeye ve sonra taze NGM plakaları için seçerek aktarmak (Toplam alma N = 50 veya N tre başına 100 hayvan = atment grup).</li>
		<li>Yeni NGM plakaları için nüfus kurtarma, 24 h aktardıktan sonra yukarıdaki takip Caenorhabditis elek ile (bkz. Adım 1.2) protokol ve başarıyla aktarılan hayvanları saymak.</li>
		<li>Hayvanlar ile karşılaştırıldığında 100 (%) ile çarpılmış transfer başlangıç sayısı başında transfer miktarının oranı olarak yüzde verim hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan deneyleri Not: healthspan parametreleri hareketliliği sınıfı, faringeal pompa hızı ve hem anterior ve posterior nazik dokunuş yanıt günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin yaş senkronize N2 hayvanlar 25 ° C'de muhafaza için puan edinildi<ol>
<li>İzleme hareketliliği<ol>
<li>Sınıf tabanlı bir sistemi (sınıf A, B ve C) temelinde hareketliliği puanları atamak Herndon vd yöntemleri takip 18. bir sıralı lojistik istatistikleri modeli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak üç deneysel grupları etkileri karşılaştırın. Not: Sınıf A bireyler kendiliğinden bir normal, sinüs desen taşımak. Sınıf B bireylerin belirgin sinüsoidal hareketlerinde taşımak ve hareketi teşvik etmek için dürtmeye gerektirebilir. C sınıfı bireyler dürtmeye karşılık onların baş ve/veya kuyruk hareket ama agar arasında hareket edemiyoruz.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Faringeal pompa hızı<ol>
<li>Değirmeni hareketi hayvanın terminal faringeal ampul bir stereomicroscope 600 X 1 dk. için son büyütme altında görsel olarak say.</li>
			<li>α ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analizi yapmak 0,05 ve Bonferroni sonrası testlerle α = 0,05 =.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dokunmatik yanıt<ol>
<li>Nazik dokunuş yanıtı kaydettikten ve üç tedavi grupları arasında karşılaştırın. Calixto vd tarafından açıklanan yöntemleri temel alan deneyleri yapmak 19.</li>
			<li>Kayıt anterior ve posterior yanıt yavaşça kirpik kıracağı dik kuyruk veya hayvanlar Başkanı (5 x, alternatif baş ve kuyruk) boyunca okşayarak tarafından dokun.</li>
			<li>Herhangi bir hareket kontur ters yönde bir ölçekte 1 puan 0-5 olarak hem anterior ve posterior yanıt için puan.</li>
			<li>α ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analizi yapmak 0,05 ve Bonferroni sonrası testlerle α = 0,05 =.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Verimlilik tahlil
	<ol>
<li>Üreme Caenorhabditis elek'ın etkisi kullanımı belirlemek için yaş zaman uyumlu N2 hayvanlar yetişkinlik 25 ° C'de 2 gün büyümeye</li>
		<li>60 yumurta sonra h hayvanlar yeni NGM tabak platin bir çekme veya Caenorhabditis elek ile transfer ve 4 h kurtarmak için onlara (20-30 dk için elenmiş tabak kuru).</li>
		<li>Kurtarma, tek tek bir kirpik ile hayvanlar NGM plakaları için almak plaka sonra onları yumurtlamak için 24 saat ver ve hayvanlar kaldırın. Döl her tabakta başka bir 24 h için 25 ° c normal şartlarda geliştirmeye olanak sağlar. Not: Tırnak cilası ile Pasteur pipet sonu için güvenli ve etanol ile sterilize insan bir kirpik kirpik kıracağı var.</li>
		<li>Uygun F1 üretimi bireylerin saymak. Bir istatistiksel analiz kullanarak bir T-test ile α = 0,05. Not: Canlı yavru başarıyla yumurtadan ve gelişimleri normal larva döngüleri ile başlayan yumurta olarak kabul edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan muhabir stres yanıt deneyleri
	<ol>
<li>Stres potansiyeli işaretleyicileri algılamak için üç yaygın olarak kullanılan floresan muhabir deneyleri yapmak: çekirdeklerin içine bir DAF-16::GFP translocation hücrelerinin bir zorlanma [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; hsp-16,2 ifade [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; ve çimen-3 ifade [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Her tahlil için 20 ° C'de üç tedavi gruplarından yaşında zaman uyumlu hayvanlar kültür ve erişkin 3 gün inceleyebilirsiniz: bir negatif kontrol kullanın (günlük olarak, el ile bir platin pick ile hayvanların bir grup transferi), pozitif bir denetim (üstünde a günlük temel bir grup hayvan platin bir çekme artı kurulan bir tetikleyici ile elle aktarmak) ve Caenorhabditis Elek (hayvanlar elekten geçirmek ve onları NGM üzerinde 30 dk önce sadece görüntüleme yeniden elde etmek için izin).</li>
		<li>DAF-16::GFP assay olarak, Isı şok olumlu denetim hayvanlar için 30 dk 37 ° C'de20Imaging önce. Hsp-16,2 tahlil için ısı şok olumlu denetim hayvanlar 90 dk,21Imaging önce 20 h için. Çimen-3 tahlil için22Imaging önce 100 mM bozması 4 h için olumlu denetim hayvanlarla tedavi.</li>
		<li>Solucanlar hemen kirpik kıracağıyla hasat ve solucanlar hareketsiz için % 36 poloxamer 407 yüzey aktif çözüm 1 μL ile bir coverslip için mount.</li>
		<li>Başka bir coverslip takılı kurtlarla sandviç. İki coverslips bir standart cam mikroskobu slayt ve görüntü ters bir Floresan Mikroskobu (için genel bir büyütme 80 X) üzerinde bir 8 X büyütme ve sürekli maruz olan bir FITC filtre kullanarak solucanlar bağlayın.</li>
		<li>DAF-16::GFP tahlil üç grup arasındaki farklılıkları algılamak için DAF-16::GFP muhabir (muhabir sitozol ve ara Eğer bulunsa muhabiri hücre çekirdeği, sitozolik translocated Eğer nükleer konumunu temel alan hayvanlar kategorilere ayırma muhabir) çekirdeği ve sitozol bulunan.</li>
		<li>Bir sıra lojistik istatistiksel model istatistiksel analiz yazılımı kullanarak sonuçları karşılaştırın. α ile tek yönlü ANOVA hsp 16,2 ve çimen-3 ifade deneyleri kullanmak için = 0,05 ve Tukey'nın post hoc testlerle α = 0,05 baş bölgesinin toplam floresans karşılaştırmak için.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_hermcellfate/hermcellfate.html">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_amchnosensation/amchnosensation.html">Assaying mechanosensation.</a> WormBook. , (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+Mitochondrial+Superoxide+Dismutase+sod-2+Extends+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (2), e1000361(2009).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), e85964(2014).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li>
<li>Argon, Y., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+fertilization-defective+mutants+with+abnormal+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm.</a> Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).</li>
<li>Lee, S. J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+longevity+response+to+temperature+by+thermosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Temperature+Differentially+Modulates+C.+elegans+Longevity+through+a+Thermosensitive+TRP+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel.</a> Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).</li>
<li>Michaelson, L. C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-2540.2000.0745d.x">C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5.</a> Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Henderson, S. T., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+integrates+developmental+and+environmental+inputs+to+mediate+aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).</li>
<li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li>
<li>Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li>
<li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li>
<li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+neuron+aging%3A+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173(2016).</li>
<li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001(2016).</li>
<li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li>
<li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li>
<li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok. Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişkileri yokluğunda yapılmıştır bildirin.

Burada, tasarım ve sıralama ve C. eleganssürdürmek için bir araç olarak kullanmak erişilebilir, etkili Caenorhabditis elek, tanıttı. Bu araç, bireysel hayvanlar, nüfus, kimyasal işlemler (Örneğin, FUDR) ve daha pahalı Yöntemler yavru hayvan yıkama el ile seçmek için çeşitli yararları vardır. İlk olarak, Caenorhabditis elek verimli ve hızlı bir şekilde büyük karışık nüfus (Tablo 2) hayvanların Döl (az 20 dk) sıralar. Ayrıca, aracın kullanımıyla hayvanların healthspan (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6) üzerinde tespit hiçbir toksik etkileri vardır, iyi tarif genetik stres gazetecilere (Şekil 7, Şekil 8 neden değil Şekil 9) ve bundan sonra uygulanan tedavi kültür plakaları veya moleküler herhangi bir tahlil etkileyen yabancı kimyasal miktarını azaltır. Kullanım kolaylığı önemli bir avantaj olduğunu; eğitimlerini herhangi bir aşamasında bir araştırmacı (resim 1 ve Şekil 2; kullanmak için eğitilmiş olabilir İletişim kuralı).
Malzemeler imalat ve elek (Örneğin, pipetler, arabellekleri) kullanımı için gerekli standart araştırma laboratuvarlarında kolayca kullanılabilir; Böylece, Eğer kırık Caenorhabditis elek değiştirin ya da tamir için pahalı değildir. Caenorhabditis elek kendini inşa doğası çok yönlü bir araç olmasını sağlar: kafes boyutu farklı C. elegans için uygun olan inşa edilecek gelişim dönemleri ve fenotipleri. Caenorhabditis elek da Nematot diğer türler veya üretim küçük organizmalar, belirtilen uygun kafes boyutunu yalıtma kullanıldığında yürütülen deneyleri kullanılabilir.
Faydaları yanı sıra bu araç sağlar C. elegans nüfus bakım, elek hayvanlar bunların kullanımı diğer deneysel uygulamalarda önce temizlemek için kullanılabilir. Örneğin, havacilik C. elegans davranış gelişimi ile araştırma çip kullanım ve temizlik sorunu gelir. Hayvanlar için bağlı bakteri miktarına bağlı olarak, özel önlemler kullanılamaz29işleme mikrosıvısal çip yapışmasına neden vermemek için alınması gerekir. C. elegans kez transfer edildiğinde bir mikrosıvısal çip, bakteriyel çim gelen kalıntı onlarla getirilir. Bu kalıntı olabilir ve sonra temizleme gerektirir çip arıza veya değiştirme yapmak mikrosıvısal kanalları yapışmasına neden olabilir. Bu iletişim kuralı aygıtı inşa sadece senkronize hayvanlar havacilik, aynı zamanda bir mikrosıvısal aygıt içine onların ekleme önce hayvan temizliği için hasat için bir yöntem sunar. Enkaz ve bakteriyel kalıntı, hayvanlar, toplarken almak yukarıya kaldırarak mikrosıvısal kanalları böylece bireysel cips operasyonel ömrünü ve onlarla birlikte yürütülen araştırma sonraki işlem hacmi artan arıza, daha az eğilimli olduğunu.

Yuvarlak solucan Caenorhabditis elegans, premier model organizmadır. Onların ekimi laboratuvarda basit ve kontrollü doğası, yanı sıra tüm onların genom sıralı1 ve her hücre gelişimsel kaderi2bilinir. Bu özellikleri nedeniyle, C. elegans genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan model bir organizmadır. Ancak, bu faydalı özellikleri ile birlikte bazı sorunlar için araştırmacılar geliyor. Onların hızlı oluşturma süresi nedeniyle C. elegans nüfus gıda dışında hızlı bir şekilde çalıştırabilirsiniz ve/veya nüfus birden çok nesiller ile karışık hale ve gelişim dönemleri aynı anda mevcut. Böylece, katı nematodunun büyüme ortamında (NGM) gerçekleştirilen deneyler bakteriyel gıda kaynak tüketir ve yeni larva geliştirmek önce hayvanlar taze tabakaları bana fiziksel olarak taşımak araştırmacılar gerektirir. Bir sık hayvanların aktarma çoluk çocuk nesiller ile karışık hale gelen deneysel örneğin alınma olasılığını önlemek için gerektiği şekilde bu sıkıcı olabilir. Yine de, bazı deneyler her iki çok sayıda hayvan ve genişletilmiş zaman puan (Örneğin, DNA veya RNA ayıklama erişkin dönemde) gerektirir. Bu doğru bir şekilde senkronize bir popülasyon sürdürmek ve hayvanlar çok sayıda aktarma sorunları bileşikleri.
C. elegans NGM üzerinde kültürlü aktarma geçerli yöntemleri seçmek veya hayvanlar tabak tabak yıkama; kimyasal tedavi hayvanlar (Örneğin, DNA çoğaltma inhibitörü fluorodeoxyuridine veya FUDR); ya da çok iyi plakaları hayvanlarda sıralamak için akış sitometresi kullanma. Malzeme çekme el ile tek tek veya birden çok hayvanlar3,4aktarmak için ince platin tel veya bir kirpik ile yapılan bir el araç kullanımını gerektirir. Bu yöntem doğru ama beceri ve zaman gerektirir ve çok sayıda hayvan içeren çalışmalar için bir kısıtlamadır. Mayıs da toplama bireyler doğal olmayan ve tutarsız miktarda bozukluğu ve kuvvet için potansiyel olarak subjecting tarafından fiziksel olarak zarar ve stresli hayvanlar için. Çamaşır bir arabellek çözüm ile bir kültür yemek durulama ve hayvanlar ile çözüm için yeni bir kültür plaka cam Pasteur pipet ile aktarma içerir. Bu yöntem hızlı ve etkili ama birden fazla nesiller ve hayvanların gelişim aşamalarında toplu olarak aktarılır olarak doğru değil. Kimyasal tedaviler, FUDR gibi herhangi bir DNA ikileşmesi ve böylece, gamet üretim ve yumurta gelişim engelleme yoluyla yavru önlemek için kodlamayla medya çözülmüş. Süre etkili, bu yöntem gelişimsel olgunlaşma sonra normal gelişim süreçleri bozmak değil olarak uygulanmış olması gerekir ve bu hala onun Yönetim3önce hayvanlar aktarmak için bir gereklilik olduğu anlamına gelir. Bu yöntem de yollar sinyal, hayvanlar üzerinde göze çarpan etkileri onlar yaş olarak sonuçlanan birden çok cep (Örneğin, bir ömrü uzatma veya değiştirilmiş bir proteostasis) kullanılan C. elegans 5suşu bağlı olarak etkiler, 6,7,8,9,10. Akış Sitometresi yöntemleri otomatik olarak sıralamak ve bireysel C. elegans bir çok iyi tabaktan başka bir11' e aktarın. Bu yöntem çok etkili ve verimli iken, akış sitometresi prohibitively pahalı ve pek çok araştırmacı için ulaşılmaz cihazıdır. Hayvanlar aktarma alternatif sıcaklık hassas sıcaklık ayarı12ile steril hale fer-15 ve fem-1, gibi mutant modelleri kullanmaktır. Mutant hayvanlar kullanarak bazı durumlarda yararlı olmakla birlikte, bu belirli suşları vahşi-türü hayvanlar daha yavaş büyür ve değiştirilmiş bir soykırım, eskime veya sağlıklı solucanlar için zavallı temsilcileri olarak hizmet veren güveniyor. Buna ek olarak, kısırlık ikna etmek için bir sıcaklık üst karakter üzerine güven aynı zamanda statik ortamı yokluğunda sonuçlar ve sıcaklık değişiklikleri kolayca gösterilmiştir gen ifadeleri13,14, etkilemek için 15. araştırma grupları daha önce teknikleri C. elegans boyutu16tarafından filtre uygulamak için bir kafes kullanımını açıklayan yayınlandı. Ancak, biz bu tür filtre kullanımı ile ilişkili olabilecek genel sağlık sonuçları herhangi bir değişiklik için test önceki iş bulmak koyamadık.
Böylece, çok sayıda hayvan kültür plakalar arasında aktarmak için ekonomik, verimli, hızlı ve doğru bir yöntem için C. elegans araştırma topluluk içinde bir ihtiyaç olduğunu. Biz ekipman ( Caenorhabditis elek olarak adlandırılır) ve onun üretim ve C. elegans araştırma topluluğu dizayn çalışması için ilişkili bir protokol bir geliştirilmiş, erişilebilir parça geliştirdik. Burada, tasarım Caenorhabditis elek ve yöntemlerin kullanımı için paylaştığımız ve biz kullanımı yaygın sağlık ya da herhangi bir stres işaretleri çift el ile malzeme çekme ve yaygın olarak kullanılan bir tedaviyle karşılaştırıldığında etki etmez göstermek, doğurganlık kısıtlama kimyasal FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) temel ve Biyomedikal araştırma bir dizi kullanılan bir iyi kurulmuş model organizmadır. Nematot araştırma topluluğu içinde C. elegansbüyük, Yaş eşlemeli nüfusu korumak uygun fiyatlı ve etkili bir şekilde gerek yoktur. Burada, mekanik olarak sıralama ve C. eleganstemizlik için bir metodoloji mevcut. Amacımız hayvanlar Tekdüzen boyutları ve yaşam evreleri deneyler kullanımları için elde etmek için düşük maliyetli, verimli, hızlı ve basit bir süreç sağlamaktır. Bu araç, Caenorhabditis elek, ortak konik Laboratuvar tüpleri konu ve gövde boyutuna göre C. elegans sıralar bir ölçüye göre kapak sistemi kullanır. Biz de Caenorhabditis elek etkili hayvanlar bir kültür tabaktan başka bir hızlı sıralama, eşitleme, sağlık, işaretçileri etkilemeden temizlik sunan ve için aktarımlarına göstermek ve stres-indüklenebilir hareketliliği dahil olmak üzere gen gazetecilere. Bu erişilebilir ve yenilikçi araç C. elegans nüfusu korumak için hızlı, verimli ve olmayan stresli bir seçenektir.

Caenorhabditis Elek 2 vidalı kapakları dokuma naylon monofilament kafes organizmaların basit yıkama tekniği kullanarak canlı nüfus ayıklamak için kullanılan istenen gelişimsel yaş, vücut çapından daha küçük bir alanı güvenliğini sağlama oluşur. Bu standart konik tüpler için ekler ve mesh ekran mekanik olarak istenen hayvanlar tüp daha fazla bakım ve deneme (Örneğin, havalesi ya da genetik hasat) hazır bırakarak gövde çapı göre hayvanlar sıralamak için kullanır. Caenorhabditis elek ile yıkama nazik bir el ile hızlı, 60-100 mm plaka başına yaklaşık 5 dk ve organizmaların kolayca kafes kazanılmaktadır.
Yüzde verim takip hayvanların Caenorhabditis Elek kullanın Caenorhabditis elek yüzde verim kurmak için cihazlar ile 20 mikron ve 50 mikron gözenek boyutu kafesleri Yetişkin hayvanlar üzerinde test edildi. A demek, verim bir > % 90 başarılı hayvan transferi test her iki kafes boyutları için (Tablo 1) elde.
Monofilament mesh farklı boyut aralıkları hayvanlar farklı yaşam aşamaları ayırmak için kullanılan. Mesh ile 20 mikron boşlukları uygun yıkama uzakta gelişmekte olan embriyo ve larva aşamaları ikinci istinat dördüncü larva sahne küçük (L4; 32 mikron bir ortalama beden çapı ile) ve mesh 50 mikron boşluklar ile tüm izin verirken daha sonraki yaşam evreleri, herhangi bir hayvan diğer yaşam uzakta (Tablo 2) yıkanması (ile 70 mikron bir ortalama beden çapı) Yetişkin bir yana aşamalarında.
Caenorhabditis Elek kullanım healthspan ölçümleri etki etmez Motilite: C. elegans normal sinüs hareketi (yani, hareketliliği) yaş18 ile azalır ve genel sağlık belirtecidir. Caenorhabditis elek hareketliliği etkiledi Eğer hareketliliği puanları olduğunu belirlemek için çekme, FUDR ve Caenorhabditis elek tedavi grupları günlerde erişkin 2, 4, 6 ve 8 karşılaştırıldığında. Her Grup genelinde tüm hayvanlar (n = 10/grup) birden çok çağlar yetişkinlik boyunca, normal ve spontan hareket desenler (A sınıfı) sergilenen (gün 2, 4, 6 ve 8 erişkin; Her gün, Şekil 3çoklu karşılaştırmalar için p > 0.05).
Faringeal pompa hızı: C. elegans faringeal kasları pompa yeteneği yaşla azalır ve healthspan23başka bir biyomarker olduğunu. Caenorhabditis elek hayvanların faringeal pompa hızı, çekme, FUDR ve Caenorhabditis etkisinde belirlemek için elek tedavi grupları gün 2, 4, 6 ve 8 erişkin karşılaştırıldı (n = 8-10 grup başına). Gün 6 malzeme çekme uygulandı hayvanlar ve FUDR yöntemleri arasında anlamlı bir fark yoktu (p < 0.001) ve 8 (p < 0.001). Ayrıca, gün 6 elek ve FUDR gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu (p < 0.001) ve günde 8 erişkin (p < 0.001). Ancak, herhangi bir gün için çekme ve Caenorhabditis elek gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (p > 0,05, Şekil 4), elek healthspan bu ölçüsü etki etmez gösteren.
Nazik dokunuş yanıt: Mekanik uyarana tepki yaşlanma veya genel sağlık24,25değerlendirmek için fizyolojik bir işaretleyicidir; Böylece, farklı aktarım yöntemlerini anterior ve posterior nazik dokunuş yanıt üzerinde etkisini test edildi. Çekme, FUDR ve Caenorhabditis arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı elek tedavi grupları (n = 8/grup), ya anteriorly ya da özafagusu, test herhangi bir gün için (p > 0,4 için tüm karşılaştırmalar; Şekil 5A ve 5B).
Verimlilik: Kurmak için olsun veya olmasın Caenorhabditis elek uygun Döl C. elegans, bireysel çoluk çocuk yetişkinlik 3 günün 24 saat süresince üretilen tarafından üretilen miktarı sayılır karşılaştırıldığında ve etkiledi (n = 20-22 grubu başına). Caenorhabditis elek kullanımını önemli ölçüde zaman bir çekme tedavi grubuna göre üretilen Döl sayısı etkisi olmadı (p = 0,61, Şekil 6).
Moleküler muhabir deneyleri DAF-16 nükleer translocation: C. elegansiçinde transkripsiyon faktörü DAF-16 aktivasyonu artan stres direnç26ile ilişkilidir. DAF-16 nükleer lokalizasyonu transgenik nematodunun zorlanma DAF-16 yeşil flüoresan protein (DAF-16::GFP)20erimiş ifade TJ356 incelenmiştir. Normal büyüme koşullarda DAF-16::GFP sitozol öncelikle yerelleştirilmiştir ama çeşitli stresler (Örneğin, ısı stres) altında hızla çekirdeği20translocated. DAF-16 translocation üzerinde Caenorhabditis elek ile sıralama etkisini test etmek için DAF-16::GFP yerelleştirmeler erişkinlerde yaş eşlemeli gün-5 bir pozitif kontrol grubunda (ısı stres) karşılaştırıldı bir negatif kontrol grubu (çekme el ile transferi), ve Caenorhabditis elek tedavi grupları (n = 10/grup). DAF-16::GFP nükleer translocation etkilemedi ve negatif kontrol hayvanlara benzer bir fenotip gösterdi Caenorhabditis elek ile transferi (p > 0,05, Şekil 7).
HSP-16,2 muhabir: küçük Isı şok proteinleri HSP-16,2 gibi biyolojik bir stres yanıtının vardır ve son derece ısı şok veya oksidatif stres ajanları21,27bir pozlama sırasında ifade edilir. TJ375 zorlanma normal şartlar21altında etkin değil bir hsp-16,2 organizatörü ile erimiş GFP muhabir gen vardır. Ancak, uzun süre bir maruz bir ısı şok, HSP-16,2 protein ifade indüklenen ve hayvanlar GFP ifade21yüksek düzeyde görüntülemek. HSP 16,2 aracılı stres yanıt Caenorhabditis elek katılımı, floresan yoğunluğu farinks bölgesinde test etmek için (n = 10 hayvanlar/grup) arasında bir pozitif kontrol grubu (ısı gün-5 erişkinlerde yaş eşlemeli hayvanların karşılaştırıldığında stres), bir negatif kontrol grubu (malzeme çekme) ve Caenorhabditis elek tedavi grubu. Transferi Caenorhabditis elek ile önemli ölçüde HSP ifade teşvik değil-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) zaman negatif denetimine göre (p > 0,05, Şekil 8).
çimen-3 muhabir: C. elegansiçinde süperoksit dismutaz (SOD-3) 3 için kodları anti-oksidan gen oksidatif stres28sırasında yukarı düzenlenir. C. elegans zorlanma CF1553 yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eder-çimen-3 organizatörü, Ifade bozması5gibi oksidatif stres tarafından indüklenen etiketli. C. elegansantioksidan yanıtta üzerinde sıralama Caenorhabditis elek katılımı sınamak için gün-5 Yetişkin yaş eşlemeli baş bölgesinin floresan yoğunluğu arasında bir pozitif kontrol nüfus (100 mikron bozması karşılaştırıldı tedavi), bir negatif kontrol nüfus (el ile malzeme çekme) ve bir Caenorhabditis elek transfer nüfus. Transferi Caenorhabditis elek ile önemli ölçüde çimen-3::gfp negatif kontrol karşılaştırıldığında ifade teşvik değil (p > 0,05, Şekil 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig1.jpg"> Resim 1: Caenorhabditis elek inşaat. Aracın 'kendin yap' üretimi progresyon gösterilmiştir. Bu paneller düzeltti kenarları kesilmiş olan merkezleri kaldırdık,(a)iki 50 mL konik tüp kapaklar (B) (C) ve (D - F) kim C. elegans istenilen hayat aşaması için karşılık gelen monofilament mesh ile donatılmış göstermek ( iletişim kuralı Ayrıntılar için bakınız). (G) tamamlanan elek de gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig2.jpg"> Resim 2: Adım adım resim gösterimi Caenorhabditis elek kullanım. (A) elek M9 çözüm bir damla ile önceden ıslak ve (B) uygun bir 50 mL konik tüp üstüne. (C) çözüm solucanlarla elek, (D) 50 mL konik tüp tüp ve (E) ile yeni iliştirilen elek içine bakan solucanlarla elek üzerine yerleştirilir topside Doğum pipetted M9 1 mL üst tüp "hızlı bir şekilde saygısız o". Elek M9 ile durulanır ver. (G) istenen hayvanlar yeni 50 mL taşıyan tüp ve solucanlar tarafından yerçekimi tüp altına yerleşmek için izin verilir. (H) solucanların pipetted ve taze NGM tabakta damlacıkları olarak yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig3.jpg"> Şekil 3: Caenorhabditis elek hareketliliği ömrü boyunca etkisi olmadı. Bu rakam gün 2, 4, 6 ve 8 için malzeme çekme, FUDR, erişkin, hayvanların hareketliliği sınıf dağılım gösterir ve Caenorhabditis elek tedavi grupları. A sınıfı hayvanlar normalde ve kendiliğinden, B sınıfı hayvanların normal olmayan bir şekilde taşındı ve dürtmeye ve C sınıfı hayvan were yapamaz-e doğru taşımak gerekli hareket. Caenorhabditis elek, çekme ve FUDR gruplar arasında fark yoktu (p > 0.05). Üç çoğaltır (n = 10 hayvan tedavi plaka başına) yürütülen ve sıralı lojistik modeli ile analiz. B sınıfı hayvanlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig4.jpg"> Şekil 4: Caenorhabditis elek kullanım ömrü faringeal pompa etkisi olmadı. Bu şekilde, FUDR, almak ve Caenorhabditis elek tedavi grupları, karşılaştırıldığında günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin faringeal pompa oranları gösterilmektedir. Elek ve FUDR tedavi grupları gün için belirtilen bir önemi çekme arasında yıldız işaretlerini göstermek (*** p < 0,05). Caenorhabditis elek ve çekme grubu (p > 0,05) arasında hiçbir fark vardı. İki çoğaltır (N = 10 hayvan tedavi plaka başına) yürütülen ve bir tek yönlü ANOVA ve Bonferroni sonrası test analiz etti. Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig5.jpg"> Şekil 5: Caenorhabditis elek kullanım ömrü boyunca anterior dokunmatik yanıt etkisi olmadı. Bu paneller(a)ön göstermek ve (B) çekme, FUDR ve Caenorhabditis arkadan dokunmatik yanıt sayısı elek tedavi grupları günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin karşılaştırılır. İki çoğaltır N ile yürütülen = 10 her tedavi grubu için ve tek yönlü ANOVA ve Bonferroni sonrası test ile karşılaştırıldığında (p = 0,4 ve p = 0,9 için anterior ve posteiror, sırasıyla). Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig6.jpg"> Şekil 6: Caenorhabditis elek yetişkinlik gün 3 uygun Döl miktarı etkisi olmadı. Gün 3 erişkin üst hayvanlar için kapsayan bu rakam gün-3 Yetişkin uygun Döl yumurta atarken bir 24 saat süre sonra gösterir. Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya gösterir. N = 20-22 hayvanları tedavi grubu başına en az iki ayrı biyolojik çoğaltır. Tedavi grupları bir tile karşılaştırıldığında-test, (p > 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig7.jpg"> Şekil 7: DAF-16::GFP nükleer translocation Caenorhabditis elek etkilemedi. Bu paneller DAF-16 translocation (A) bir ısı şok grup (pozitif kontrolü), (B) bir çekme grubu (negatif kontrol) ve (C) bir Caenorhabditis elek tedavi grubu temsilcisi görüntülerini göster. (D) DAF-16 nükleer translocation an harekete geçirmek hayvanlar pozitif kontrol grubunda görüntülenir. Caenorhabditis elek bir nükleer translocation teşvik değil ve sitozolik füzyon protein hayvanlara benzer negatif kontrol grubunda görüntülenir. N = 10 hayvan başına en az üç ayrı biyolojik çoğaltır grubundan tedavi. Tedavi grupları tek yönlü ANOVA ve bir Tukey'nın post hoc testi ile karşılaştırıldı. Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig8.jpg"> Şekil 8: Hsp16.2::gfp ifade Caenorhabditis elek etkilemedi. Isı şok grup (pozitif kontrolü), bir çekme grubu (negatif kontrol) ve Caenorhabditis elek tedavi grubunda (rasgele floresan biriminde) HSP-16,2 ifadelerin karşılaştırılır. Yıldız işaretlerini hsp16.2::gfp diğer tedavi gruplardan önemli ölçüde farklı pozitif kontrol grubu için yüksek bir ifade belirtmek (*** p < 0,05). Caenorhabditis elek hsp16.2::gfp ifade etkilemez mi ve floresan yoğunluklarda hayvanlara benzer negatif kontrol grubunda görüntülenir (p > 0.05). Üç çoğaltır N ile yürütülen = 10 her tedavi grubu için ve tek yönlü ANOVA ve bir Tukey'nın post hoc testi ile karşılaştırıldığında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig9.jpg"> Şekil 9: Çimen-3::gfp ifade Caenorhabditis elek etkilemedi. 100 μm kalınlığında bozması grubu (pozitif kontrolü), bir seçim grubu (negatif kontrol) ve Caenorhabditis elek tedavi grubunda SOD-3 ifadeleri (rasgele floresan biriminde) gösterilir. Yıldız işaretlerini çimen-3::gfp diğer gruplardan farklı pozitif kontrol grubu için yüksek bir ifade belirtmek (*** p < 0,05). Caenorhabditis elek çimen-3::gfp ifade etkilemez mi ve floresan yoğunluklarda hayvanlara benzer negatif kontrol grubunda görüntülenir (p > 0.05). Üç çoğaltır N ile yürütülen = 10 her tedavi grubu için ve tek yönlü ANOVA ve bir Tukey'nın post hoc testi ile karşılaştırıldığında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kafes boyutu</td>
			<td>N = 50</td>
			<td>N = 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mikron</td>
			<td>%95.33</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mikron</td>
			<td>%99,00</td>
			<td>%93.33</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: yüzde verim kafes boyutlarda. Bu tablo sonuçlar gösterir N ile test bir 20 mikron cihazın 3 çoğaltır ve N ile sınanan 50 mikron aygıt için 50 Yetişkin = 50 yetişkinler için 2 çoğaltır = ve = N ile 100 için 3 çoğaltır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kafes boyutu</td>
			<td>Gelişimsel sahne</td>
			<td>Gövde çapı</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mikron</td>
			<td>Larva evre 4</td>
			<td>~ 35 mikron</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mikron</td>
			<td>1. gün yetişkin</td>
			<td>~ 70 mikron</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: ortalama beden çapı. Bu tablo 3 ölçümleri eşit her solucan 15 hayvanlar için her ölçülen hayat aşamasında yayılmış sayı ortalaması alınarak elde kötü gövde çapı görüntüler.

Watch this Scientific Journal Video about Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms at JoVE.com

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Geçerli protokol sıralama ve nüfus yaş eşlemeli temizlik için bir metodoloji içerir Caenorhabditis elegans. Nematodlar araştırma için büyük bir deneysel nüfusa elde etmek için basit, ucuz ve verimli özel yapım aracı kullanır.

Caenorhabditis Elek: Bir düşük teknoloji enstrüman ve küçük çok hücreli organizmalar sıralama yöntemi

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K Görüntüleme.  University of Alaska Fairbanks. Geçerli protokol sıralama ve nüfus yaş eşlemeli temizlik için bir metodoloji içerir Caenorhabditis elegans. Nematodlar araştırma için büyük bir deneysel nüfusa elde etmek için basit, ucuz ve verimli özel yapım aracı kullanır.

Video: Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Gelişim Biyolojisi

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Çevre

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetik

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community size structure responds to biotic and abiotic gradients, including anthropogenic perturbations across taxa and ecosystems. However, the manual measurement of small-bodied organisms such as benthic macroinvertebrates (e.g., &gt;500 &#181;m to a few centimeters long) is time-consuming. To expedite the estimation of community size structure, here, we developed a protocol to semi-automatically measure the individual body size of preserved river macroinvertebrates, which are one of the most commonly used bioindicators for assessing the ecological status of freshwater ecosystems. This protocol is adapted from an existing methodology developed to scan marine mesozooplankton with a scanning system designed for water samples. The protocol consists of three main steps: (1) scanning subsamples (fine and coarse sample size fractions) of river macroinvertebrates and processing the digitized images to individualize each detected object in each image; (2) creating, evaluating, and validating a learning set through artificial intelligence to semi-automatically separate the individual images of macroinvertebrates from detritus and artifacts in the scanned samples; and (3) depicting the size structure of the macroinvertebrate communities. In addition to the protocol, this work includes the calibration results and enumerates several challenges and recommendations to adapt the procedure to macroinvertebrate samples and to consider for further improvements. Overall, the results support the use of the presented scanning system for the automatic body size measurement of river macroinvertebrates and suggest that the depiction of their size spectrum is a valuable tool for the rapid bioassessment of freshwater ecosystems.

The article is based on the creation of an adapted protocol to scan, detect, sort, and identify digitized objects corresponding to benthic river macroinvertebrates using a semi-automatic imaging procedure. This procedure allows the acquisition of the individual size distributions and size metrics of a macroinvertebrate community in about 1 h.

Riverine Makroomurgasızlarının Topluluk Boyut Yapısını Belirlemek için Otomatik Görüntü İşleme

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Biyomühendislik

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

Sıralanması<em&gt; Streptomyces</emKarmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Ayırıcı Kullanma&gt; Hücre Peletleri

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Biyoloji

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Caenorhabditis Elek: Bir düşük teknoloji enstrüman ve küçük çok hücreli organizmalar sıralama yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama'yı Akışı Sitometrinin tarafından