Iki günlük eski sıvı büyütülmüş kültürden sıralama Streptomyces pelet analiz ve işlem şematik olarak Şekil 1 &#39;de temsil edilir. Yöntem için ayrıntıları aşağıda verilmiştir. 1.. (Medya ve Tamponlar hazırlanması dahil) Büyüme <ol><li> 10x fosfat tamponlu tuzlu su 1 L hazırlanması (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g 2 HPO 4, pH 7.4 &#39;e ayarlandı damıtılmış su, 1 L 2.4 g KH 2 PO 4 Na). Kullanım sırasında PBS içinde 1 L elde etmek üzere damıtılmış su içinde 900 ml 10x PBS 100 ml. </li><li> Yeme ortamı 1 L hazırlayın (3 g Difco maya özütü, 5 g Bacto pepton, 3 g Oxoid malt özü, 10 g glukoz, 340 g sakaroz, 1 L damıtılmış su kadar) ve 2.5 M MgCI2, 100 ml. Otoklav hem çözümler sterilize edin. Başka Streptomyces ortamı 4,14 kullanılabilir unutmayın. </li><li> Bir 100 ml yeme orta ve 0.2 ml 2.5 M MgCl2 eklemesteril 250 ml Erlenmeyer şişeye metal sarmal yay ile donatılmıştır. Çalışma bakteri örnekleri olduğu kadar çok şişeler hazırlayın. </li><li> 10 6 spor / ml &#39;lik bir spor konsantrasyonunun elde edilmesi için Streptomyces 10 8 sporları, her şişe inoküle. 180 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de 2 gün boyunca bakteri büyütün. </li></ol> 2. Örnekleme <ol><li> 5 ml steril bir pipet kullanarak 15 ml Falcon tüpüne her kültürden 5 ml örnek aktarın. Numune bütün kültür için temsili sağlamak için numune alma sırasında yavaşça kültür çalkalanır. </li><li> Numuneler COPAS ile hemen analiz edildiğinde hiç numune hazırlama adım gereklidir. Buz üzerinde örnek tutmak ve bu protokolün 3.1 adıma geçin. Numuneler daha sonraki bir zaman noktasında incelendiğinde, adımlar bu protokolün 2,3-2,5 açıklandığı gibi granül düzeltin. Uygun şekilde analizana sonra temizlenmiş zaman tespit da boru sistemindeki bakteri büyümesini engeller unutmayınes. Formaldehit aşağı analizleri engellemektedir değildir ile bu sabitlenmesini sağlamak. Örneğin, RNA formaldehid ile tespit sonrası mantar granül izole edilemedi. Bunun aksine, RNA başarılı bir şekilde% 70 etanol 12 ile tespit sonra izole edildi. </li><li> Numunenin, 5 ml% 37 formaldehit 600 ul ilave edin ve 3 kez tüp ters çevirerek karıştırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri düzeltildi. </li><li> Santrifüj 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de sabit bir rotor içinde 2,500 x g de örnekler. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 5 ml PBS ile granül yıkayın. </li><li> Peletler 2x PBS ile yıkanmakta, böylece adım 2.4 tekrarlayın. Numuneler bir kaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde saklanabilir. </li></ol> 3. COPAS Analizi <ol><li> COPAS Artı, pompa, bilgisayar ve 488 nm argon lazer açık ve Biosort yazılımı başlatmak emin olun. Açık olsa da, lazerin bekleme modus olacaktır. </li><li> Kılıf sıvısı şişesi dolu ve kontrol edinatık şişesi boş. </li><li> Üzerinde bekleme konumundan 488 nm argon lazer geçiş ardından &#39;start&#39; ve &#39;RUN&#39; tıklayın. Lazer açıkken sonra yaklaşık 60 sn, &#39;YAPILDI&#39; tıklayın. </li><li> Basınç göstergelerini kontrol edin. &#39;Kılıf&#39; için baskılar, &#39;Örnek&#39;, &#39;Sıralayıcısı&#39; ve &#39;Temiz&#39; sırasıyla yaklaşık 4.0, 0.5, 2.7, ve 10,9 okumalısınız. </li><li> Bir sonraki &#39;Basınç OK&#39; için onay kutusunu tıklatın. Sistem daha sonra akış hücresi hazırlar ve kullanıma hazırdır. </li><li> Standart ayarlar 11, &#39;Erteleme&#39; ve &#39;Genişlik&#39; 7 ile kabul edilir. Eşikleri-saati uçuş temsil TOF ile, &#39;TOF Minimum&#39; için &#39;Sinyal&#39; için, 50 ve 40 olarak ayarlanır. (Bütünlüğü için: Bütün &#39;kar&#39; 1 ayarlanır, tetik 2.50 MHz seçilir &#39;tarama hızını seçin&#39; EXT (Extinction) ve altında &#39;Ayarlar&#39; sekmesinden ayarlanır Tesadüf &#39;Gelişmiş&#39; ayarlanır.). </li><li> Örnek Kupası&#39;nın arta kalan suyu çıkarınd, birlikte (yaklaşık 50 mi) PBS ile aşama 2.2 ya da bir kap içinde, 2.5 den Streptomyces numune 0.1 ml. Emin olun örnek fincan düzgün kapalıdır. </li><li> Veri toplama başlatmak için &#39;Al&#39;ı&#39; tıklayın. Saniyede 30-50 olaylar arasında elde akış hızını yönetmek. Akış çok yüksekse, numune fincan PBS ekleyin. Akış hızı çok düşük ise, daha fazla örnek eklemek. </li><li> En az 2,500 olaylar tık &#39;DUR&#39; toplandığı zaman. Tüm veri tık &#39;Store&#39; kaydetmek ve sonraki istatistiksel analiz için dosyayı kaydetmek için. Biosort yazılım sadece. Txt dosyası sonraki analiz için kullanılacak olan, dört dosyaları verileri kaydetmek olacaktır. </li><li> Bir 50 ml şırınga ve su ile 2 kez yıkama ile örnek kaldırarak bir numune kabı temizleyin. </li><li> Tüm örnekleri analiz edilinceye kadar tekrarlayın 3,7-3,10 adımları. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> . Txt dosyası açın ve (örneğin MS Excel kullanılarak) 25 daha düşük bir EXT ile veri atın. Bu4,12 (Aspergillus niger 150 daha düşük bir EXT tüm veriler atılır) enkaz ve gevşek hifal fragmanları karşılık gelir. &#39;. Txt&#39; Öyleyse, (: Birçok veri dosyaları bu mevcut programlama dili R, otomatik edilebilir bir ovada tek sütunda dosyayı tüm TOFs kaydedin <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Emin SciLab (sürüm 5.3.2 veya daha yeni http://www.scilab.org/ itibaren) bir araya kılavuzda mevcuttur &#39;fittools&#39; kütüphane, birlikte yüklü olduğundan emin olun: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Scilab başlatın ve verileri modellemek için fittools kütüphanesinin gerekli fonksiyonları çalıştırın. Kısacası: (sadece bir kez ihtiyaç) kılavuzda gösterildiği gibi fittools kütüphane kurun. <ol><li> Fittools kitaplığı yüklenemedi. </li><li> Scilab içine verileri (&#39;. Txt&#39; dosyası) okuyun. </li><li>(Doğal log varsayılan günlük fonksiyonu) verileri dönüştürmek yapın. </li><li> Veri 2 nüfus modeli Fit. </li><li> Histogram ve modeli (opsiyonel) ile bir grafik çizilir. </li><li> Veri (1000 kopya) önyüklemesi. </li><li> Önyükleyicisini kümeleriyle modeli Fit. </li><li> Güven 5 parametrelerin tahminlerinin aralıkları olsun. Bu nüfus, bunların 2 aracı (μ 1 ve μ 2) ve beraberindeki standart sapmalar (α 1 ve 2 α) katılımı fraksiyonu (p) hakkında bilgi verecektir. Ayrıca,% 95 güven aralıkları 12,13,15 (1000 kopya) önyükleme sonra modelle takarak belirlenir. Araçlarının güven aralıkları örtüşmeyen ve p güven aralığı 0,025-0,975 arasında olduğunda kümesi Normal dağılımların iki nüfus bir birleşimi olarak açıklanabilir. (Th Notbüyük topakların katılma 1 ise küçük topakların katılımı kısmını p, bir -. p) TOF ve Streptomyces pelet çapı arasındaki ilişki 0,57 x TOF + 159 um 4 eşittir. </li></ol></li><li> Durumda iki nüfus üst olarak COPAS parametreleri sıralama olarak kullanımı ortalama TOFs bulunan ve daha sonra küçük ve büyük granül sıralamak bağlı düşük. Diğer sıralama parametreleri kullanıcı taleplerine bağlı olarak seçilebilir unutmayın. </li></ol> 5. Pelet Sıralama <ol><li> Aşama 3.7 açıklandığı gibi dizildi gerekmektedir Streptomyces örnek yükleyin. </li><li> &#39;Sınırları sıralanması&#39; Set ve minimal (Lo) ve maksimal (Selam) TOF değerleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Alternatif olarak, &#39;Bölgeler&#39; ve ardından istenilen boyutlarda veya özelliklere sahip granül seçmek için &#39;Kapı Region Define&#39; seçerek bir alan ayarlayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe yerleştirinsıralama parametrelerini karşılamak birden pelet toplamak. Alternatif olarak, bir mikro-titre plaka bireysel peletleri sıralamak için kullanılabilir. Çoklu peletleri (10 4 -10 5) DNA ve protein çıkarımı için ihtiyaç vardır. Tek bir pelet gen ekspresyonunun QPCR analiz için yeterli olmakla birlikte, çok sayıda granül RNA sıralaması için ihtiyaç vardır. </li><li> Karar verin ve sıralanması gerekiyor pelet sayısını ayarlamak ve seçilen parametreler için sıralamak için &#39;Sıralama Manuel tıklayın. Pelet miktarı ayarlanır ulaşıldığında, sıralama otomatik olarak sona erer. </li><li> Numune kabının bir 50 ml şırınga ile numune üzerinde kalan çıkarın ve 2 kez su ile bardak yıkayın. Diğer örnekler kriteri gerekiyorsa tekrarlayın 5,1-5,5 adımları. </li><li> Kapatmadan önce COPAS kalan peletler bertaraf ve% 70 EtOH ve / veya su içinde% 2 hipoklorit ile bir numune kabı temizlemek için su ile bir numune kabı durulama. Tüm sistemi temizlemek ve su ile bu tekrarlamak klorlu suyun bir örnek çalıştırın. Boş to kabı ve temiz taşma veya Container bulunduğu filtresini değiştirin. </li><li> Bittiğinde, sistem basıncı serbest bırakmak için &#39;DUR&#39; tıklayın. Motor durur programı kapatın ve &#39;tasfiye olmadan Kapat&#39; tıkladığınızda. Ardından bilgisayarı, COPAS, lazer ve pompayı kapatın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Klonal nüfus 6 heterojenite anlayışımıza katkıda tek hücre çok sayıda yüksek hızlı analiz sağladı Flow sitometri. Normal akış sitometri Streptomisetler ve çok hücreli mantar misel peletlerin analizi için uygun değildir. Çalışmalarımız Streptomyces peletler yüksek verimli analiz copas ile mümkün olduğunu göstermiştir. Burada özetlenen prosedürü, basit, hızlı ve son derece tekrarlanabilir. Enstrümanın işlem sırasında akılda tutulması gereken önemli parametre (adım bu protokolün 3.8) 100 olay / sn geçmemelidir akış hızı vardır. Pelet konsantrasyonu ve bu nedenle de akış hızı çok yüksek olursa, gösterge bireysel peletleri tespit etmek için başarısız olduğundan, TOF değerleri yanlış hesap edilir. Yeterince PBS eklenmesi ile örnek seyreltilmesi bu sorunun üstesinden gelmektedir. Sınırlamalar COPAS Artı kullanımı<html> d buradan 30-700 um arasında değişen bir boyuta sahip parçacıkları ölçmek için uygun olan 1 mm, bir meme çapı vardır. Bu nedenle, meme Streptomisetler tarafından oluşturulan peletler ölçüm sağlar. Filamentöz mantarların durumunda mikro koloniler COPAS Plus genel uygulanabilirliğe sınırlayan, daha büyük olabilir. COPAS XL boyutu 1.500 um kadar parçacıkları ölçmek ancak çaplı alt bölgesindeki duyarlılık COPAS Plus ile karşılaştırıldığında daha azdır. COPAS Plus ve COPAS XL Hem 30 mikron daha küçük parçacıkları analiz edemezsiniz. Bu bireysel mikrobik sporlar veya hücreleri analiz edilemez anlamına gelir. Buna ek olarak, COPAS doğru sporlar ve hücreler ya da çok küçük mikro kolonilerin küçük agregalar analiz olmayabilir. Bunun için, normal cep analiz kullanılmalıdır. Bu sınırlama, 1-1,500 mikron aralığında partikül analiz Union Biometrica en Biosorter tarafından yenilmektedir. Satın alma ödül Ancak yüksektir. t &quot;&gt; Sorun Giderme COPAS kullanımı kolay sağlam bir araçtır. Ancak, bazen peletler numune fincan içine, bir örnek yükleme ve ölçüm sonrasında başlangıç ​​algılanmaz. Nedeni genellikle kolayca &#39;temiz&#39; komutu basılarak çözülebilir bir tıkanmış giriş tüp vardır. Bu, numune fincan içine geri boru sistemi pelet zorlar. Alternatif bir sebep kapak düzgün numune kabının üzerinde yer olmadığını olabilir. Bu basınç kaybı ve pelet tespit etmek için birlikte neden olmaktadır. Önemi ve gelecekteki yönelimler Biz burada topak büyüklüğüne analizine odaklanmış ama COPAS kurulum da analiz edebilmek ve çeşit floresan ve yoğunluğuna dayanır. Floresan algılama GFP gibi gazetecilere dayalı gen ifadesini analiz için bize sağlar. Bundan başka, hücrelerin bileşim değerlendirilebilir. Daha güçlü Bu parametreler göre pelet ayırmak için seçenekçözücüleri. Kriteri topaklar her omik çalışmaları dahil olmak üzere alt analizi için kullanılabilir. Nitekim, daha önce 60.000 büyük ve 200.000 küçük granül sıralanır ve proteom büyük ve küçük saçmalar 4 arasında anlamlı derecede farklı olduğunu göstermiştir. Bu teknoloji, bu nedenle hücre fabrikalarında olarak Streptomycet&#39;ler geliştirmek için yeni yol sağlar. COPAS teknolojisinin önemli yararı zaman. Hücre peletleri ile ilgili daha önceki çalışmalarda mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve bu birkaç yüz 16 kadar analiz edilebilir pelet sayısını sınırlar edilmiştir. Mikroskopi çalışmalar zaten sıvı yetiştirilen Streptomyces kültürleri 16 pelet iki nüfus varlığını göstermiştir. Gerçekten de, pelet iki popülasyonu farklı Streptomisetler 4, çok sayıda bağımsız olarak kültür koşulları tespit edildi. Bu boyut heterojenlik ipliksi Streptomisetler ile sınırlı değildir, aynı zamanda lifli mantar 12 gözlenmiştir &lt;/ Sup&gt;. Tüm durumlarda, heterojenite altında yatan mekanizmalar henüz bilinmemektedir. Pelet sıralamak olasılığı büyüklüğü ve floresan göre bu tür mekanizmalar çözülmeye bize sağlar.

Streptomisetler filaman toprak iyi antibiyotik için kendi yeterlilik için bilinen bakteri, hem de bağışıklık bastırıcı ya da mantar enfeksiyonlarının ya da kanser 1,2 mücadele etmek için kullanılabilir bileşiklerdir. Buna ek olarak, bu organizmalar endüstriyel uygulamalar 3 geniş bir aralığı için ilgi çekici olan enzimleri üretir. Ticari olarak ilgi çekici bileşiklerin çoğu, biyo-reaktörlerde üretilir. Biyoreaktörlerde Streptomisetler büyüme kümeleri veya granül olarak bilinen, birbirine hif kompleks yapıların oluşumu ile karakterizedir. Bu çok hücreli yapılar büyüklüğü 4 ile ilgili son derece heterojen ve Escherichia coli veya Bacillus subtilis gibi tek hücreli bir bakterinin daha fazla bir milyon kat daha büyük boyutlarda ulaşabilirsiniz. Heterojenlik, doğal biyolojik sistemlerde 5 faydalı bir özellik olarak kabul edilmektedir, ancak, bu sektörde, üretim tuzak olarak kabul edilir. BioReaktör kültivasyonları mümkün olan en yüksek verimi elde etmek için tekrarlanabilir ve denetlenebilir olması gerekir. Bir biyoreaktör içinde topak tiplerinin her birinin rolü detaylı bir anlayış, bir hücre fabrikası gibi Streptomisetler geliştirmek için, bu nedenle çok önemlidir. Akış sitometrisi yaygın bir popülasyonda 6 tek tek hücrelerin analiz etmek için kullanılır. Akış sitometrelerinde aynı anda (örneğin büyüklüğü, yoğunluğu ve renkli floresan gibi) hücrelerin özelliklerini ölçerek multiparametrik bilgi edinebilirler. Bu şekilde, hücre özellikleri böylece eden bir kültürün içinde heterojenite anlaşılması ve hücrelerin 6 farklı popülasyonlarının varlığı katkıda ilişkili olabilir. Daha özelleşmiş enstrümanlar kullanıcı-tanımlı parametrelere göre mümkün hücreleri sıralamak için yaptık. Örneğin, mutantlan taranabilir. Sıralama sonra, bu tür mutant hücreler daha fazla karakterizasyon için yetiştirilebilir. Bu zaten diğerleri arasında, yararlı olduğu kanıtlanmıştır,suşları 7,8 verimliliğini artırmak için. Akış sitometre Memeler, tipik olarak yaklaşık 10 um arasında bir maksimum çapa sahip hücrelerin geçişine izin verir. Bu nedenle, Streptomycet&#39;ler topakları düzenli akış sitometrelerinde ile analiz edilemez. Bununla birlikte, Kompleksi Nesne Parametrik Analyzer ve Sıralayıcısı (COPAS) ile analiz edilebilir. Düzenli bir akış sitometrelerinde gibi, COPAS yüksek verim şekilde parçacıkların multiparametrik veri elde edebilirsiniz. Copas türüne bağlı olarak, 10-1,500 um büyüklüğünde parçacıklar, analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu tür DNA, RNA ya da protein izolasyonu olarak kültivasyonu veya alt analizler için kullanılabilir bireysel partiküllerin, sıralama için olanak sağlar. COPAS başlangıçta örneğin nematod Caenorhabditis elegans 9 ve Drosophila embriyolar ve larva 10 gibi küçük hücreli organizmaların, analiz ve sıralama için tasarlanmıştır. Araçlar da Zebra balığı 11 a süredir kullanılmaktadırnd ipliksi mantarlar 12,13 için. Bu ikinci filaman organizmalar da bakteriler tarafından oluşturulanlar daha büyük olan misel topakları oluşturulur. Yakın zamanda copas kullanımı da Streptomisetler 4 için uygun olduğunu göstermiştir. Burada ölçülerine uygun granül sıralamak için yöntem ile ilgili bilgileri de dahil olmak üzere, Streptomyces coelicolor pelet heterojen değerlendirmek için copas kullanmak için deney prosedürü açıklar. Bu yöntem aynı zamanda, diğer topak oluşturucu Streptomisetler analizi için kullanılabilir ki, lütfen unutmayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomisetler enzim ve antibiyotik üretimi için endüstride kullanılan ipliksi toprak bakterilerdir. Biyoreaktörlerde yetiştirildiğinde, bu organizmalar boyut olarak heterojen granül olarak bilinen, birbirine hif ağları oluşturan. Burada analiz etmek için bir yöntem tarif ve sıralama misel topakları karmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Sıralayıcısı (COPAS) kullanarak. Detaylı talimatları alet ve verilerin istatistiksel analizi temel kullanımı için verilmiştir. Biz ayrıca bu tür RNA veya protein içeriğinin analizi olarak aşağı işlenmesini sağlayan, kullanıcı-tanımlı ayarlara göre pelet sıralanabilir anlatacağız. Bu metodoloji kullanarak mekanizma yatan heterojen büyüme ele olabilir. Bu verimlilik pelet büyüklüğü ile ilişkilidir gerçeği göz önünde bulundurarak, bir hücre fabrikası olarak Streptomycet&#39;ler geliştirmek için vesile olacaktır.

Streptomyces pelet COPAS ölçümleri Streptomisetler boyutlarının geniş bir aralığı vardır sıvı kültürlerde misel topakları oluşturulur. Topak boyutu dağılımının analiz etmek için, bir 2-günlük sıvı yetiştirilen Streptomyces coelicolor kültür, 1 mm meme ile donatılmış bir COPAS Ayrıca Profiler sitometrisi kullanarak, büyük bir tanecik akışa tabi tutuldu. Tipik COPAS çıkışı, Şekil 2A&#39;da görselleştirildiği gibi bir saçılma grafiğidir. X-ekseni topak boyutuna (yani lazer ışını geçirmek için daha büyük topaklar için daha uzun sürer) ile bağlantılı olan, time-of-flight (TOF) temsil eder. Y-ekseni, nesnenin optik yoğunluğunu temsil etmektedir sönme gösterir. Saçılan arsa içinde her bir nokta, lazer ışını geçirerek, tek bir topak, yani, tek bir olaya karşılık gelir. Numune, çok konsantre olduğunda (lazer 100&#39;den fazla etkinlik / saniye algıladığında örneğin) önemlisi, COPAS sıkça bireysel p tespit etmek için başarısızellets. Bu çok yüksek olduğu yanlış TOF değerlerine yol açar. Örneğin seyreltilmesi daha seyreltme artık etkisi TOF yapan bir noktaya kadar, ortalama TOF değerleri azaltır. Yaklaşık 100 pelet / sn analiz edildiğinde bu nokta ulaşılır. Bir histogram içine veri noktaları çizme boyutları normal olarak (Şekil 2B) dağılmamaktadır gösterir. Dağılımı sağa etkiye sahip gibi görünmektedir. Veri setini dönüştüren log da bir normal dağılım (Şekil 2C) yol açmamıştır. Boyut dağılımı, veri matematiksel 12,15 modellenmiştir iki normal dağılımların bir karışımının varsayılarak ile izah edilebilir olup olmadığını değerlendirmek. Modelleme gerçekten de granül boyutu dağılımı, iki farklı popülasyonlarının varlığını varsayarak açıklanabilir olduğunu göstermiştir. Küçük topaklar nüfusu, 248 um arasında bir ortalama boyutu olan topaklar, tüm% 92 meydana geliyordu büyük pel nüfusu(tüm pelet% 8) 319 um&#39;lik bir ortalama boyuta sahip (popülasyonlar katılım fraksiyon% 2,5-97,5 arasında olduğu zaman mevcut olduğu varsayılır unutmayın) sağlar. Büyüklüğüne göre Streptomyces pelet sıralama Büyük ve küçük pelet nüfus mikro-koloniler dizildi. Bu amaçla, iki popülasyonun ortalama tane boyutları sıralama için sınırlarını tanımlamak için kullanılmıştır. 319 um &#39;den daha büyük topaklar büyük topak popülasyon (Şekil 3) ait olduğu kabul edildi ise, iki boyutta örtüşen kısmından pelet sıralama sınırlamak için 248 um den daha küçük granüller, küçük topak popülasyonundan olarak kabul edildi dağılımlar. Sıralanmış pelet mikroskobik analizi onların farklı boyutlarını (Şekil 3) gösterdi. Toplanan peletler ayrıca DNA, RNA ya da protein izolasyon için kullanılabilir. &lt;img alt = &quot;Şekil 1&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt;: İçerik-genişliği fo = &quot;5in&quot; Şekil 1.. COPAS kullanarak Streptomyces pelet ölçmek ve analiz etmek için deney düzeneği şematik. Ayrıntılar için, deneysel prosedürleri bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Sıvı-yetiştirilen Streptomyces kültürlerde Şekil 2.. Pelet boyutu heterojen. 2 günlük eski S. COPAS analizi coelicolor yeme kültürü (A) (Uçuş değerlerin Zamanda olarak gösterilen) pelet boyutları normalde dağıtmak olmadığını gösterird (B), ve ne olur bu nedenle zaman log-transforme (C). Bunun yerine, TOF farklı (ve dolayısıyla boyut) pelet iki popülasyonu tespit edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Şekil 3,. (Mavi ile gösterilen) 319 um &#39;den daha büyük bir boyutu olan topaklar büyük topaklar olarak kabul edildi ise ölçülerine uygun Streptomyces pelet Fraksiyonu. Granüller bir boyutu (pembe olarak gösterilmiştir) 248 um den küçük, küçük granül olarak kabul edildi. Mikroskobik inceleme büyüklüğü farkı doğruladı. Bu boyutlar TOF ile d arasındaki ilişkiyi tarif kullanılarak log-transforme edilmiş verilerden hesaplanmıştır unutmayın0.57 × TOF + 159 um eşit bir Streptomyces pelet iameter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sıvı yetiştirilen Streptomyces kültürleri boyut olarak heterojen misel topaklar ile karakterize edilir. Burada analiz etmek için bir yöntem tarif ve yüksek verimli bir şekilde bu sıralama peletler. Bu pelet büyüme heterojenitesini anlamak ve kontrol etmek için yol sağlayacak ileri analizler için kullanılabilir.

Sıralanması<em&gt; Streptomyces</emKarmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Ayırıcı Kullanma&gt; Hücre Peletleri

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K Görüntüleme.  Leiden University.  Sıvı yetiştirilen Streptomyces kültürleri boyut olarak heterojen misel topaklar ile karakterize edilir. Burada analiz etmek için bir yöntem tarif ve yüksek verimli bir şekilde bu sıralama peletler. Bu pelet büyüme heterojenitesini anlamak ve kontrol etmek için yol sağlayacak ileri analizler için kullanılabilir. 

Video: Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Biyoloji

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...