저자는 그녀의 초기 공헌 연구 설계에 대 한 헤더 Currey 박사 Swarup Mitra 원고 그의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 마이클 B. 해리스 박사 의견, 개선,이 방법론의 시범 생산 지원을 감사 하 고 싶습니다. 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 간행물에서 보고 된 연구에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 UL1GM118991, TL4GM118992, 또는 RL5GM118990 국립 보건원의와 제도적 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 번호 5P20GM103395-15 국립 보건원의. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. UA는 AA/EO 고용주 및 교육 기관 및 개인에 대 한 불법 차별 금지: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. 꼬마 체 건설 및 사용
<ol><li>
건설 프로토콜
	<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브 (그림 1A)에서 2 뚜껑을 얻을.</li>
		<li>(하단, 그림 1B에서 볼) 때 뚜껑의 안쪽 입술 안쪽 중심 영역을 제거 분 젠 버너와 뜨거운 금속 프로브 또는 납땜을 사용 하 여 또는 드릴 비트를 강화. 참고: 상해의 위험이 있기 때문에 블레이드 보다는 플라스틱 뚜껑을 열을 사용 하 여입니다.</li>
		<li>청소 하 고 잘라 가장자리를 모래 톱 곡선된 파일 또는 로타리 연마 도구 (예를 들어, Dremel) 표면. 그림 1C참조.</li>
		<li>적절 한 지름 (그림 1D) monofilament 메시의 동그라미를 잘라. 이 위해, monofilament 나일론 메쉬 시트에 뚜껑을 추적 하 고 그려진 라인 안에 그냥 잘라.</li>
		<li>접착제 (그림 1E) 플라스틱에 적용 되 면 두 개의 뚜껑의 접착을 강화 하는 뚜껑의 위쪽 표면에 홈/슬래시 잘라.</li>
		<li>에탄올과 뚜껑을 깨끗 하 고 건조 그들을 보자.</li>
		<li>외부 가장자리를 유지 하는 두 뚜껑의 위쪽 표면에 cyanoacrylate 접착제를 적용 합니다. 참고: 접착제 조금 먼 길을 간다.</li>
		<li>하나 붙어 뚜껑 (그림 1 층)에 표 1에 따라 monofilament 메쉬를 하다. 메쉬; 위에 거꾸로 두 번째 뚜껑을 배치 두 뚜껑 함께 그들의 꼭대기를가지고 있어야 합니다. 단단히 함께 (그림 1G)을 누릅니다. 메쉬 긴장 된 인지 확인 합니다. 참고: 안전 조치로, 뚜껑에는 메쉬를 사용 하 여 족집게.</li>
		<li>접착제의 초기 레이어는 건조 되 면 뚜껑 사이의 외부 간격 주위 cyanoacrylate 접착제의 링을 적용 합니다. 이 무결성을 추가 하 고 떨어져 또는 새 어떤 필 링 방지 관대 한 수 있습니다.</li>
		<li>필터 monofilament 메시의 메시 기 공 크기와 레이블을 지정 합니다. 참고: 여기, 우리가 사용 하 여 두 개의 메시 기 공 크기-20 µ m, 50 µ m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜을 사용 하 여
	<ol>
<li>미리 체 젖은.<ol>
<li>염 분 해결책, M9 등 플라스틱 [5 g의 NaCl, 나2HPO46 g, KH2포4, 1 초순 H2O, L 그리고 MgSO4 (1 M)의 1 mL의 3 세대]17, 방울 양식까지 체의 센터를 통해 압축, 및 필터 아래쪽 (그림 2A)의 중심에서 drips. 필요에 따라 모양 아래쪽에 보풀 지우기 (예, Kimwipe)을 적용 하거나 메시에 수 분 물방울을 확산.</li>
			<li>50 mL 원뿔 튜브 위에 체를 놓습니다. '폐 튜브' 튜브 라벨 (그림 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>한 천 배지에서 C. 선 충 의 인구를 씻어.<ol>
<li>M9 버퍼와 접시 세척 하 고 한 번 (그림 2C)에 웜 포함 된 매체 monofilament 메쉬 1 mL의 위쪽에 배치. 메시의 중심에서 작동 해야 합니다. 모든 벌레는 접시에서 씻는 다. 참고: 일반적으로, 60 m m 플레이트 m 9의 3 mL 충분 하다.</li>
			<li>Pipetting에 벌레의 수를 최소화 하기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서와 메쉬 센터 (필요에 따라 반복)에 벌레를 이동.</li>
			<li>상단에서 M9 버퍼와 필터를 씻어. 다시, 메시의 센터에서 운영 하 고 그 지역에서 모든 벌레를 헹 굴에 있는지 확인 하십시오. 모든 박테리아와 작은 벌레는 메시를 통해 전달 되도록 필요한 만큼 여러 번 씻는 다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>체에서 크기 일치 하는 동물을 수확.<ol>
<li>단계의 새 컬렉션 튜브 (그림 2D)의 내부를 직면 하는 1.2.2.3 어른 벌레와 체의 상단에 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 연결 합니다.</li>
			<li>첫 번째 관 (폐기물 관)을 제거 하 고 신속 하 게 체 고을 드롭릿에 마이그레이션 하는 것을 막기 위해 새로운 튜브를 뒤집어 (그림 2E). 참고: 무 균 필요 하지 않은 경우 사용 하 여 보풀 지우기 (예, Kimwipe) 윅 유체를 튀기기 전에 메시의 하단에서.</li>
			<li>새로운 위쪽 (그림 2F)에서 새로운 50 mL 튜브에 M9와 메쉬 린스. 다시, 메쉬 센터에서 운영 하 고 메시의 밑면에 작은 물방울을 유지 합니다.</li>
			<li>정착 하거나 부드럽게 아래로 회전 웜 허용 (예를 들어, < 16 x g) 약 1 분 (그림 2G).</li>
			<li>에 벌레, 펠 릿에서 버퍼 솔루션을 이상적으로 발음 > 0.5 mL, 또는 펠 릿을 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거.</li>
			<li>플라스틱 유리 NGM 접시에 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 웜 하 고 그들을 건조. 공간 여러 방울 밖으로 새로운 접시에 그래서 그들은 더 빠른 (그림 2 H)를 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>체를 청소.<ol>
<li>에탄올과 역방향 삼 투 물으로 체를 부드럽게 하 고 철저 하 게 린스. 건조 하자.</li>
			<li>무기한 미래의 사용에 대 한 깨끗 한 용기에 그것을 저장 합니다.</li>
			<li>메시 "sag" 외관을 개발 했을 때 그것을 폐기.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 꼬마 체 정렬 방법의 유효성 검사
<ol><li>일반 유지 보수
	<ol>
<li>모든 실험에 대 한 문화 표준 선 충 류 성장 미디어17 에 벌레 (NGM의 1 L 펩, 한 천, 3 g의 NaCl, 이중 증 류 물, 5 mg/mL 콜레스테롤, 1 M CaCl2 의 1 mL의 1 mL의 975 mL의 17 g의 2.5 g의 구성 1 mL의 1 M MgSO4, 1m KHPO4, 25 mL 및 100 mg/mL 스의 0.5 mL) 25 ° c.에</li>
	</ol></li>
	<li>실험 치료 관리
	<ol>
<li>3 치료 그룹을 비교: 선택, fluorodeoxyuridine (FUDR), 그리고 꼬마 체.<ol>
<li>FUDR 치료 그룹에 대 한 NGM 미디어 어떤 자손 생산을 방지 하기 위해 100 μ M의 최종 농도를 100mg/mL FUDR을 추가 하 고 매일 음식 소모를 피하기 위해 신선한 NGM 접시에 벌레를 전송.</li>
			<li>선택 그룹에 대 한 선택 하 고 웜 백 금 루프를 사용 하 여 수동으로 전송 합니다.</li>
			<li>꼬마 체 치료 그룹에 대 한 1.2 단계를 수행 하 고 플라스틱 NGM 접시에 벌레.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>꼬마 체 백분율 수확량
	<ol>
<li>C. 선 충분류에 얼마나 효과적인 체는 계량, 25 ° C (즉, 달걀 누워 후 48 h)에서 성년의 날 1 세 동기 N2 동물을 성장 하 고 신선한 NGM 접시에 그들을 수확 하 여 그들을 전송 (총 N = 50 또는 N = 트 레 당 100 동물 atment 그룹)입니다.</li>
		<li>24 시간 복구의 새로운 NGM 번호판 인구 전송 후 다음 위의 꼬마 체와 프로토콜 (단계 1.2 참조) 하 고 성공적으로 전송 된 동물의 수를 계산.</li>
		<li>100 (%)을 곱한 전송의 시작 부분에 시작 번호에 비해 전송 하는 동물의 수의 비로 백분율 수확량을 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan 분석 실험 참고: 일 2, 4, 6, 및 8 나이 동기화 N2 동물 25 ° c.에 유지에 대 한 성인 기의 운동 성 클래스, 인 두 펌프 속도 및 모두는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답의 healthspan 매개 변수를 점수<ol>
<li>추적 운동<ol>
<li>클래스를 기반으로 시스템 (A, B 및 C 클래스)에 따라 운동 성 점수를 할당 Herndon 외 의 방법에 따라 18. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 세 가지 실험 그룹의 효과 비교. 참고: 클래스 A 개인 일반, 정현파 패턴에서 자연스럽 게 이동합니다. 클래스 B 개인 현저 하 게 비 정현파 움직임에 이동 하 고 장려 운동 괴롭히는 필요할 수 있습니다. 클래스 C 개인 괴롭히는에 그들의 머리 또는 꼬리를 이동 하지만 agar 가로질러 이동할 수 없습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>인 두 펌프 속도<ol>
<li>1 분에 대 한 최종 배율 X 600 stereomicroscope에서 시각적으로 동물의 터미널 인 두 전구의 분쇄기 움직임을 계산 합니다.</li>
			<li>Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>터치 응답<ol>
<li>부드러운 터치 응답을 기록 하 고 3 개의 치료 그룹 사이 비교. Calixto 연구진이 설명 하는 방법에 따라 분석 실험을 수행 19.</li>
			<li>레코드는 앞쪽 및 후부 부드럽게 쓰 다듬어 속눈썹 선택 수직 꼬리 또는 동물의 머리 (5 x, 번갈아가 며 머리와 꼬리) 하 여 응답을 터치 합니다.</li>
			<li>앞쪽 및 후부 응답에 대 한 0 ~ 5의 규모에 1 점으로 선의 반대 방향으로 움직임을 점수.</li>
			<li>Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>통치 분석 결과
	<ol>
<li>25 ° c.에 성년의 날 2에 나이 동기 N2 동물 복제에 꼬마 체의 영향의 사용을 확인 하려면 성장</li>
		<li>달걀 누워 후 60 h 플래티넘 선택 또는 꼬마 체 새로운 NGM 번호판 동물을 전송 하 고 그들 복구에 4 h (20-30 분에 대 한 체질된 접시 건조).</li>
		<li>복구, 개별적으로 접시 속눈썹 통해 동물 NGM 번호판 선택 후 그들에 게 산란, 24 h 하 고 동물을 제거 합니다. 또 다른 24 h에 대 한 25 ° C에서 표준 상태 하에서 개발을 각 접시에 자손을 허용 합니다. 참고: 속눈썹 선택은 인간의 속눈썹 매니큐어와 파스퇴르 피 펫의 끝을 확보 하 고 에탄올으로 소독.</li>
		<li>실행 가능한 F1 세대 개인의 수를 계산 합니다. Α와 T-검정을 사용 하 여 통계 분석을 수행 = 0.05. 참고: 가능한 자손 계란 성공적으로 해치 고 일반 애벌레 사이클을 통해 그들의 개발을 시작 하는 것으로 간주 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 기자 스트레스 응답 분석 실험
	<ol>
<li>스트레스의 잠재적인 마커를 감지 하 세 가지 일반적으로 사용 되는 형광 기자 분석 수행: 스트레인 [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; 세포의 핵에 DAF 16::GFP 전 hsp-16.2 식 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; 그리고 잔디-3 식 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>각 분석 결과 대 한 문화 20 ° C에서 3 개의 치료 그룹에서 나이 동기 동물 및 성년의 날 3에 그들을 검토: 부정적인 제어를 사용 하 여 (매일, 수동으로 백 금 선택과 동물의 그룹 전송), (매일에 긍정적인 통제 백 금 선택 플러스 설립된 스트레스와 수동으로 동물의 그룹 전송), 그리고 꼬마 체 (체 동물을 통과 하 고 이미징 직전 NGM에 30 분 동안 복구 하도록 허용).</li>
		<li>DAF 16::GFP 분석 결과에서 열 충격을 30 분 동안 37 ° C에서 긍정적인 제어 동물20이미징 하기 전에. Hsp-16.2 분석 결과 대 한 열 충격 90 분,21이미징 하기 전에 20 h 긍정적인 제어 동물. Sod-3 분석 결과 대 한 이미징22전에 4 h 100 m m 파라콰트와 긍정적인 제어 동물을 취급 합니다.</li>
		<li>속눈썹 선택으로 즉시 벌레를 수확 하 고 벌레를 무력화 하는 36% poloxamer 407 계면 활성 솔루션의 1 μ와 coverslip에 탑재.</li>
		<li>다른 coverslip로 탑재 된 웜 샌드위치 표준 유리 현미경 슬라이드 및 이미지를 두 개의 coverslips 벌레는 거꾸로 형광 현미경 (80 X의 전반적인 확대)에 8 배 확대와 지속적인 노출 FITC 필터를 사용 하 여 탑재 합니다.</li>
		<li>DAF 16::GFP 분석 결과에서 세 그룹 간의 차이 감지, DAF 16::GFP 기자 (핵 기자 기자 cytosol, 그리고 중간에 있는 cytosolic 핵을 translocated 경우의 위치에 따라 동물 분류 기자 핵 그리고 cytosol에 위치한).</li>
		<li>통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 결과 비교 합니다. Hsp-16.2 및 잔디-3 식 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 α와 = 0.05와 Tukey의 임시 게시물 테스트 α = 0.05 머리 영역의 총 형광 비교 하.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. 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R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan.">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li><li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit.">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li><li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neuron+aging:+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).</li><li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis.">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).</li><li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li><li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress.">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li><li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다. 저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

여기, 우리 디자인 및 정렬 및 선 충 C.유지를 위한 도구로 서, 효과적인 꼬마 체의 사용을 소개 했다. 이 도구는 수동으로 개별 동물, 인구, 화학 치료 (예를 들어, FUDR), 그리고 더 비싼 방법 분리 동물의 세척을 따기 위해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬마 체 효율적이 고 신속 하 게 (20 분 미만) 동물 (표 2)의 큰 혼합된 인구에서 자손을 정렬. 또한, 도구를 ...

선 충 벌레, 꼬마 선 충, 최고의 모델 생물 이다. 실험실에 있는 그들의 경작의 간단 하 고 제어 특성, 뿐만 아니라 그들의 전체 게놈 시퀀스1 이며 각 셀의 개발 운명2알려져 있다. 이러한 기능을 구현, C. 선 충 유전자 연구에 대 한 널리 사용 되는 모델 생물 이다. 그러나, 이러한 유익한 특성 함께 연구자에 대 한 몇 가지 과제를 올. 그들의 빠른 생성 시간 때문에 C. 선 충 인구 음식에서 신속 하 게 실행할 수 있습니다 또는 여러 세대와 인구 혼합 되 고 발달 단계를 한 번에 제시. 따라서, 고체 선 충 성장 매체 (NGM)에서 수행 하는 실험 연구자 세균 식량 고갈 시키고 새로운 애벌레 개발 하기 전에 물리적으로 신선한 번호판 동물 이동에 필요 합니다. 이 자식 세대와 혼합 되 고에서 실험적인 인구를 방지 하는 데 필요한 동물의 빈번한 전송 지루한 될 수 있습니다. 아직도, 실험 동물 및 확장된 시간 포인트 (예, 성인 기에 DNA 또는 RNA 추출)의 둘 다 다 수 필요합니다. 이 정확 하 게 동기화 된 인구를 유지 하 고 전송 하는 동물의 많은 수의 문제 화합물.
C. 선 충 NGM에서 양식 전송의 현재 방법 따기 또는 세척 동물 격판덮개; 화학적 치료 동물 (예를들면, DNA 복제 억제 물 fluorodeoxyuridine 또는 FUDR); 또는 cytometry 정렬 다 잘 판에 동물을 사용 하 여. 따기 개인 또는 여러 동물3,4를 수동으로 전송 하는 얇은 백 금 철사 또는 속눈썹로 만든 손 도구를 사용 하 여를 포함 한다. 이 방법은 정확한 하지만 기술 그리고 시간 요구 이며 동물의 많은 수를 포함 하는 연구에 대 한 제한. 또한 5 월을 따기 되며 물리적으로 손상 동물에 스트레스 잠재적으로 힘의 부 자연스럽 고 일관성 없는 금액에 개인을 쓰는 하 여. 세척 포함 버퍼 솔루션 문화 접시를 헹 구 고 새로운 문화 접시에는 동물 들과 함께 솔루션 유리 파스퇴르 피 펫을 통해 전송 됩니다. 이 방법은 신속 하 고 효율적인 하지만 여러 세대와 동물의 발달 단계는 대량에서 전송에 정확 하지 않다. FUDR, 같은 화학 치료는 차단 어떤 DNA 복제 그리고 이렇게, 생식 체 생산 및 계란 개발 통해 자손의 생산을 방지 하기 위해 자란 미디어에 녹아 수 있습니다. 동안 효과, 즉, 자사의 관리3이전 동물을 전송 하는 요구는 여전히 그리고 정상적인 발달 과정을 방해 하지로 발달 성숙 후이 메서드를 적용 해야 합니다. 이 메서드는 또한 여러 개의 셀룰러 신호 경로, 결과 동물에 눈에 띄는 효과 (예를 들어, 수명 연장 또는 변경 된 proteostasis) C. 선 충 사용5의 변형에 따라 영향 6,,78,,910. 교류 cytometry 방법을 자동으로 정렬 하 고 다른11한 멀티 잘 플레이트에서 개별 C. 선 충 을 전송. 이 방법은 매우 효과적이 고 효율적인 동안 흐름 cytometry 장비는 엄청나게 비싼 많은 연구원에 액세스할 수 있습니다. 동물을 전송 하는 대신 온도 등 그다지 15 fem-1, 온도 조정12살 균 되는 민감한 돌연변이 모델을 사용 하는 것입니다. 돌연변이 동물을 사용 하 여 하는 것이 어떤 상황에 유용 하지만 이러한 특정 변종 야생-타입 동물 보다 느리게 성장 하 고 그들은 에이징 또는 건강 한 벌레에 대 한 불 쌍 한 대표자로 봉사 하는 변경 된 게놈에 의존. 또한, 무 균을 유도 하기 위해 온도 변화에 대 한 의존도 또한 정적 환경의 부재에 발생 하 고 온도 변화 유전자 식13,14, 에 영향을 쉽게 표시 되었습니다 15. 연구 그룹 이전 크기16 C. 선 충 을 필터링 하는 메시의 사용을 설명 하는 기술을 출판. 그러나, 우리가 이전 작품 어떤 변화 같은 필터의 사용과 관련 된 전반적인 건강 결과에 대 한 테스트를 찾을 수 없었습니다.
따라서, 문화 판 사이의 동물의 많은 수를 전송 하기 위한 저렴 한 가격, 신속, 효율적이 고 정확한 방법에 대 한 C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 필요 하다. 향상 된, 액세스할 수 (라는 이름의 꼬마 체) 장비 및 그것의 제조 및 C. 선 충 연구 커뮤니티의 요구를 충족 하는 작업에 대 한 연결된 프로토콜의 조각을 개발 했습니다. 여기, 우리 꼬마 체 및 그 사용 방법의 디자인을 공유 하 고 우리는 그것의 사용 영향을 주지 않는 일반적인 건강 또는 표준 수동 채집 및 치료는 일반적으로 사용 되에 비교 될 때 어떤 스트레스 마커 입증 다 산 제한 화학 FUDR

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

꼬마 선 충 (C. 선 충)은 기본 및 생물 의학 연구의 범위에 걸쳐 사용 되는 기초가 튼튼한 모델 유기 체. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 C. 선 충의 큰, 나이 일치 하는 인구를 유지 하는 저렴 하 고 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 기계적으로 정렬 및 청소 C. 선 충에 대 한 방법론을 제시. 우리의 목표는 동물의 균일 한 크기와 실험에 그들의 사용에 대 한 생활 단계를 비용 효과적, 효율적, 빠르고 간단한 프로세스입니다. 이 도구, 꼬마 체 사용 사용자 뚜껑 시스템을 일반적인 원뿔 실험실 튜브에 스레드 및 선 충 C. 신체 크기에 따라 정렬 합니다. 우리 또한 그 꼬마 체 효과적으로 동물에서에서 전송 하나의 문화 접시는 빠른 정렬, 동기화, 및 건강의 표시를 영향을 주지 않고 청소에 대 한 다른 허용 보여 운동 성 포함 하 고 스트레스를 유도할 수 있는 진 기자입니다. 이 접근 가능 하 고 혁신적인 도구 C. 선 충 인구를 유지 하기 위한 빠르고, 효율, 비-스트레스 옵션입니다.

꼬마 체 이루어져 있다 2 나사 모자, 짠된 나일론 monofilament 메쉬 간단한 세척 기술을 사용 하 여 생물의 라이브 인구를 추출 하는 데 사용, 원하는 개발 시대의 몸 직경 보다 작은 영역을 확보. 그것은 표준 원뿔 관에 부착 하 고 메쉬 스크린을 사용 하 여 기계적으로 동물 몸 직경, 튜브에 추가 유지 관리 및 실험 (예를 들어, 전송 또는 유전 수확)에 대 한 준비?...

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.

꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K 조회수.  University of Alaska Fairbanks. 정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.

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Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

연구

유전학

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

면역학 및 감염병학

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

신경과학

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

생물학

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

의 정렬<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여&gt; 셀 펠렛

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

종에 구애받지 않는 단일 조직 응용 분야를 위한 레이저 미세 해부

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Caenorhabditis elegans 내장의 손 해부

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Caenorhabditis elegans의 단일 세포 해리: 살아있는 세포를 분리하는 방법

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론

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기본

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