Rana Adeel Ahmad FCP arıtma yardım için teşekkür. Prof. Claudia Büchel yararlı tartışmalar için kabul etti ve el yazması okuma. Bu eser Alman Araştırma Vakfı'na LD (DI1956-1/1) ve Feodor Lynen bursu için ld Humboldt Vakfı tarafından desteklenmiştir

Not: Fotosentetik kompleksleri FCPs gibi ışık ve ısı için son derece açıktır. Her zaman buz üzerinde ve bir çok loş ışık altında çalışır.
1. yalıtım FCP hücrelerden
<ol><li>
Thylakoid yalıtım C. meneghiniana hücrelerden
	<ol>
<li>C. meneghiniana her ASP-orta23,25 ve 50 milyon hücre ile 300 mL dolu beş 500 mL şişe içinde büyümek. Şişeler ile pamuk Tıpa tak ve hücreleri bir shaker 16 h ışık ile 120 rpm'de yaklaşık bir hafta için üstel büyüme aşaması ve 8 h 40 µmol photons/(m²s) beyaz ışık karanlık aşamasında ve 15-18 ° c arasında bir sıcaklık için büyümeye izin Cep numarasını 1.5-2 milyon hücre/mL bir hücre sayaç odası arasında olup olmadığını kontrol edin.</li>
		<li>4000 x g yüksek hızlı santrifüj 15dk için bir precooled Open End-500 mL santrifüj tüpleri (4 ° C) ile de hücreleri santrifüj kapasitesi. Hücre topakları homojenizasyon arabellek (HB, Tablo 1) 12 ml pipetting tarafından yeniden askıya alma.<ol>
<li>Süspansiyon tek 50 mL plastik tüp aktarın. -80 ° C'de örnekleri depolamak veya 1.1.3 adıma geçin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Boncuk fabrikası ve donanımları önceden serin. Boncuk Değirmen %75 50 mL kabı bir cam boncuk karışımı ile doldurun ve hücre süspansiyon ekleyin. Hücre bozulması için 30 ile tam hızda 7 x 45 s darbeleri kullanın her darbe arasında soğutma s. 20 µL kalite kontrolleri için kesintiye hücre içinde 1.1.6 adım.</li>
		<li>Kesintiye hücreleri bir cam filtre huni ve yıkama üzerinde net göründükleri kadar HB cam boncuklar dökerek filtre. Havuzu yıkama kesir ile filtrate. Son ses 150 mL daha düşük tutun.</li>
		<li>Örnek üç 50 mL Plastik tüpler hücre artıkları cips kullanarak 140 x g de 15 dakika santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant 20 mL Polikarbonat ultrasantrifüj şişeleri için transfer ve Pelet.<ol>
<li>Şişeleri HB ile doldurmak, ağırlık equilibrate ve 300.000 x g ve thylakoid membran cips 4 ° C, 1 h için uygun bir Open End santrifüj kapasitesi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Santrifüjü tam zamanı 1.1.3 içinde alınan 20 µL örnek ile 400 X büyütme, mikroskobu tarafından kesintiye hücre oranı kontrol etmek için kullanın. Kloroplast ücretsiz ve frustules (silis kabukları) içeren kloroplast arasındaki oran hesaplamak. Not: Diatom hücre duvarları çok madde içinde mikroskop diffracting olarak görünür silis yapılır. Hücre bozulma işe yaradıysa kadar yeşil noktalar meydana gelen kloroplast hücrelerden serbest bırakılmış olması gereken.</li>
		<li>İle membran Pelet mümkün olduğunca küçük çamaşır tampon olarak yeniden askıya alma (0.5-1 mL) küçük bir ressamın fırça kullanarak. Arabellek (Tablo 1) yıkama ile Polikarbonat ultrasantrifüj şişeleri doldurun, onların ağırlık ve 200.000 x g ve 4 ° c, 20 dk santrifüj equilibrate<ol>
<li>Bir ressamın fırça ile yıkanmış membranlar yeniden askıya alma. Çamaşır arabellek yalnızca mümkün olduğu kadar yüksek thylakoid konsantrasyonu tutmak için gerekirse ekleyin. Tüm thylakoids bir örnek flakon (15 mL) havuz.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnek 10 µL % 100 aseton 90 µL ile kullanarak örnekleri önceden oranında seyreltin. 12.000 x g zarlarını protein cips 5 min için de santrifüj kapasitesi. Predilution 10 µL alıp % 90 aseton 990 µL ile karıştırın.<ol>
<li>Klorofil a ve c 664 absorbans (ABS) ölçmek nm ve 630 nm % 90 aseton içinde. Her iki değer üzerinden ABS750nm çıkarma. Aşağıdaki formülü kullanarak toplam klorofil içeriği belirlemek:24 1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq1.jpg"> 2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toplam klorofil 1,5 mL tepki tüpler 0.5 mg bazı bölümlerinde aliquot thylakoids onları sıvı azot içinde dondurma ve-80 ° C'de kadar daha fazla kullanılmasını depolayabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ayrılık ve FCP kompleksleri ile konsantrasyonu
	<ol>
<li>Sükroz degrade çözüm hazırlamak ve ultracentrifuge tüpler yükleme birimi (300-500 µL) eksi üst kadar doldurun. Onlar tamamen donmuş kadar tüpler-20 ° C'de dondurmak. 4 ° C'de 3-4 h 17 mL tüp için alır, çözülme tüpler izin.<ol>
<li>İki kez daha iyi çözünürlük için degrade iyileştirmek için donma-çözülme döngüsünü tekrarlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Klorofil 0.5 mg için karşılık gelen 1.1.9 elde örnekleri kullanır ve arabellek B1 ile ayarlamak (Tablo 1) son hacmiyle 2 mL. Solubilization için n-Lauryl-β-D-maltopyranoside (b-DDM) 20 mM son bir konsantrasyon için ekleyin.<ol>
<li>Tüp 3 kez ters çevir ve buz yumuşak köpük önlemek için sallayarak ile 20 dakika yerleştirin. Önceden soğutulmuş Masa Üstü Santrifüj 4 ° C'de 12.000 x g de 5 dk santrifüj</li>
		</ol>
</li>
		<li>Süpernatant degradeyi tarih yüklemek. 17 mL şişe kullanılan degrade başına toplam klorofil 125'ten fazla µg yük değil. Santrifüj için 100.000 x g ve 4 ° c, 22 h<ol>
<li>İstenen kahverengi FCP kesirler (Şekil 2A) kullanarak degrade yeniden elde etmek. 5 µL aliquot al ve B1a 995 µL ile sulandırmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir UV-VIS-spektrofotometre 370-750 nm arasında absorbans (ABS) spektrum ölçmek. Yarı mikro optik cam cuvettes kullanın.<ol>
<li>Spectra Yöneticisi yazılımını açın, spektrum moduna gidin ve bir satır taban çizgisinden 370 750 için kayıt nm örnek ölçümleri tarafından takip. Kullanma ertesi gün koyma: tarama hızı, 200 nm/dak; veri aralığı, 0.5 nm; Yanıt, orta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir micropipette ile kurtarılan örnek hacmi ölçmek. FCP kompleksleri B1 arabelleği (Tablo 1) ile iki kez kurtarılan birim ekleyerek yıkayın. Membran yoğunlaştırıcı 30 kDa 1000 x g ve 4 ° C en az 20 ABS672nm için kesme ile konsantre. Not: B-demir konsantrasyonu micelle zenginleştirme örnek yerde nedeniyle artış olabilir. Bu FCP kompleksleri daha fazla solubilization için neden olabilir! Aşırı solubilization deterjan boş arabellek adımları daha fazla yıkama Eğer B1 kalan sükroz kaldırmak için gerekli ekleyerek kaçının.</li>
		<li>20 µL denetimleri için aliquot al. Şok örnekleri sıvı azot donma ve onları-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig2.jpg"> Şekil 2: arıtma FCP, spektroskopik denetimleri ve saflık onay. (A) tipik görünümünü sükroz yoğunluğu degrade sonra gece Santrifüjü. FCPa ve FCPb. pigm. oluşan FCP havuz bütün kahverengi grupları içeren - ilişkisiz pigmentler, PS - FCP photosystems (B) absorbans spectra (mavi çizgi) önce ve sonra santrifüj filtre aygıtından 30 kDa kesme (turuncu kesik çizgi) konsantrasyonu . Özellikle, karotenoidler kaybı için 500-550 nm arasındaki bölgede alt absorbans sonuçlanır FCP üzerinden yatkındır. Grafikler klorofil Qy ~ 670 maksimum için normalleştirilmiş nm. (C) klorofil a emisyon spectra chl c uyarma ile (465 nm) fonksiyonel uyarma enerji transferi test etmek için. Enerji için chl chl c aktarırsanız bir engel oluyor, ~ 640 bir ek floresans band nm (chl c) oluşur. Grafikler maksimum emisyon için normalleştirilmiş. (D) uyarma spectra kaydedilen 675 nm (chl bir floresan maksimum) enerji transferi chl için test etmek için bir bütün pigmentler 370 arasında emici üzerinden nm ve 600 nm. Enerji için chl aktarırsanız bir daha az verimlidir, floresans verim özellikle 465 ve 550 nm arasında azaltmak. Grafikleri en fazla yaklaşık 440 normalleştirilmiş nm. Spectra (b), (C) ve (D) konsantrasyonu iyi çalıştı Eğer neredeyse aynıdır. (E) Tris-tricine jel28kullanarak izole FCP saflık için kontrol edin. FCPa ve FCPb alt birimleri arasında 18-19 kDa var. Tüm görünür gümüş lekeli 20 kDa büyük kirletici maddeleri proteinlerdir. Thyl. -Thylakoids <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>
Spektroskopik ve jel tabanlı denetimler
	<ol>
<li>Kayıt absorbans FCP 5 µL B1a 995 µL adım 1.2.5 sonra içinde 370-750 nm arasında. 1.2.4. adımda elde spektrum ile karşılaştırın. Aynı araçları ve 1.2.4. adımda açıklandığı gibi ayarlarını kullanır.<ol>
<li>Veri *.csv verebilir ve bir elektronik tabloya veri alabilirsiniz. Her iki spectra chl maksimum normalize bir civarında 672 Qy bandında Şekil 2Btasvir nm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1.2.4 ve 1.3.1. adımdaki örnek seyreltme faktörü 0.03 istenen ABS672nm tarafından ölçülen ABS672nm bölerek hesaplayın. Buna göre örnekleri seyreltik B1a ile ve özel cam floresans cuvettes için aktarabilirsiniz.</li>
		<li>CHL sağlam ışık enerjisi transfer chl c chl bir (Şekil 2C) ortaya çıkarmak için bir spectrofluorometer ile floresan emisyon spektrum kaydedin.<ol>
<li>Spektrometre yazılımı kullanabilir ve spektrum ölçüm modu aşağıdaki ayarlarla gidin: modu, emisyon; yarık genişliği uyarma ve emisyon, 3 nm; duyarlılık, orta; tarama hızı, 100 nm/dak; veri aralığı, 0.5 nm; uyarma dalga boyu, 465 nm; emisyon, 600-800 nm. Autozero ve ölçü gerçekleştirmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uyarma spectra aynı örnek ve bozulmamış enerji transferi tüm pigmentler chl ortaya çıkarmak için donatım (Şekil 2B) kaydedin. Değiştirmek için ayarları: modu, uyarma; emisyon dalga boyu, 675 nm; uyarma, 370-600 nm. Spectra kaydedin.<ol>
<li>Lamba- cfspektral özellikleri için aynı aralıkta rodamine spektrum ile düzeltin. Kullanıcı el kitabındaki yönergeleri.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mix FCP örnekleri chl 1 µg için karşılık gelen bir 10 µL SDS-yükleme arabelleği ile. 25 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya Santrifüj 12000 x g masa üstü santrifüj içinde de 5 min için.<ol>
<li>Tris-tricine jel28süpernatant yükleyin. Bu 150 V 2 h için ayrı ve gümüş-bu ayrılık40sonra leke. Not: İki önemli protein grup arasında FCPa ve FCPb29 (2E rakam) bileşenlerinin çoğu 18-19 kDa FCP alt birimleri ayrı.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. lipozomlar ve FCP ortaklığın hazırlanması
<ol><li>
Lipid karışımı ve lipid deterjan micelles hazırlanması Not: lipidler oksidatif koşulları ile kombine sıcaklık sıcak duyarlı. Lipidler soğutulmuş ve bir N2 atmosfer altında tutmaya çalışın.<ol>
<li>İstenen thylakoid lipid oranları C. meneghiniana için Vieler ve ark. 200730göre hesaplar. Supplemental Tablo 1' de verilen örnek bakın. Lipid bir çözelti geçirmez Konteyner üreticisi tarafından önerilen hisse senedi çözümleri hazırlayın.</li>
		<li>Lipidler 2 mL tepki tüp içinde istenilen miktarda pipette ve nazik azot akışı kullanarak kloroform buharlaşır ve lipidler tüp tabanının bütün alana yayılmış çalışın. Tüm çözücü buharlaşan kadar N2 akışı sağlar.</li>
		<li>N-Oktil β-D-glucopyranoside çözüm (OG) 29 µL lipid karışımı 4 h Incubate lipid karışımı 30 ° C'de 10 dakika için 4 ° C'de solubilize 3 x 3 dk 30 tarafından kesintiye 25 ° C'de bir sonicator banyoda lipidler kuluçkaya s buz üzerinde.<ol>
<li>Tricine arabellek 221 µL ve 4 x diyaliz arabelleği 250 µL ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir ekstruder 0,1 µm Polikarbonat Membranlar ile 50-70 nm tanımlanmış lipozom çapı için kullanın. Ekstruder membran ve filtre desteği ile bir araya getirin. Hava kabarcıklarını önlemek ve derleme iyice sıkın.</li>
		<li>4 x diyaliz arabellek ile bir şırıngaya doldur ve hava kabarcığı yok ikinci şırıngada görülebilir kadar ekstruder önceden ıslak.</li>
		<li>Lipid-deterjan-micelles için Ekstruder uygulamak ve diğer bir şırınga çözümden ileri tuşuna basın ve geri. Çözüm homojen görünene kadar bu 5 kez tekrarlayın. Not: Bu çözüm 4 ° C'de birkaç gün boyunca saklanır. Dondurma değil!</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FCP kompleksleri ve deterjanlar ve toplamları kaldırma Not: Biz bir lipid/chl 12:1 oranında kullanın örneğin, hangi yaklaşık 100: 1 bir lipid/protein oranına karşılık gelir.<ol>
<li>FCP chl 20 µg için eşit eklemek bir toplam hacmi 500 µL 250 μhaddelenmiş lipid micelles L B1a arabelleğe ve diyaliz arabellek x 4 250 µL içinde. Örnekleri 1500-3000 devirde buz üzerinde 30 s duraklamadan kesintiye thermomixer 25 ° C'de 3 x 3 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Dört 1,5 mL tepki tüp altında hala kapağını uygun bir yüzüğü vermek üst kapağını kesmek. Diyaliz membran 1.5 cm x 1,5 cm adet hazırlamak ve 20 mL 1 x diyaliz arabellek yıkayın</li>
		<li>Her kapak için örnek 250 µL doldurun. Dikkatle, membran kapak üzerinde yuvası ile örnek tamamen dolu ve hiçbir hava kabarcıkları oluşur düzenleyin. Derleme tepki tüp halka kapalı bir bölme için sıkın.</li>
		<li>Gecede 1 diyaliz arabellek x 50 mL (12-16 h) örneklerinde bir yuvarlanan shaker buz üzerinde diyaliz. Kullanılan diyaliz tampon yerine taze bir ve kalan deterjanlar için en az 6 h kaldırmak için adsorbent boncuk 7 mg ekleyin.</li>
		<li>Diyaliz arabellek tekrar eski yerine koymak ve diyaliz membran ile 200 µL micropipette bahşiş piercing tarafından lipozomlar başka bir 12 h. kurtarmak için diyaliz ve tepki tüp kapak üzerinden tüm lipozomlar Aspire edin.</li>
		<li>İsteğe bağlı adım: Eğer yüksek saflıkta (> % 95) gereklidir. Kesintili yoğunluğu Gradyanda 17 mL % 6, % 10, % 15 ve % 20 sükroz epichlorhydrin kopolimer diyaliz arabelleği içeren adımlarla ultrasantrifüj tüpleri hazırlayın. Lipozomlar üstte ve ultracentrifuge 100.000 x g sallanan bir kova Open End 4 h için de yük.<ol>
<li>Üst kahverengi bant şırıngayla kurtarmak, DP ile örnek 1:5 oranında seyreltin ve sonraki adıma geçin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En az 2 ml 1 x 100.000 x g ve 4 ° c, 1,5 saat için diyaliz arabellek FCP lipozomlar santrifüj kapasitesi Lipozomlar santrifüj tüpü bir 45 ° açıyla çevirerek kurtarmak. Lipozomlar 1 dk (Şekil 3A) aşağı taşımak izin verir.</li>
		<li>Çökelti rahatsız edici son hacmi 25-50 µL. FCP lipozomlar önlemek yeniden elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kontroller 1: absorbans, floresans spektroskopisi
	<ol>
<li>3 µL aliquot FCP lipozomlar, 1 x diyaliz arabellek ve santrifüj 12.000 x g de 5 min için 1 mL son hacmi ekleyin.<ol>
<li>FCP-lipozomlar aynı ekipman ile 370 ve 750 nm arasında absorbans 1.2.4 içinde açıklandığı gibi kaydedin. Spektrum chl (670-680 nm) Sy bölgesinde maksimum normalleştirmek ve çözündürüldükten FCP (Şekil 3 c) normalleştirilmiş spektrum karşılaştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>DP 1 ml bir absorbans (ABS) ile FCP lipozomlar hazırlamak 0,03 ile ilgili 670-680 nm arasında maksimum =. 1.2.6. adımdaki deterjan ile B1a sulandrarak aynı ABS için solubilized FCP ayarlayın.</li>
		<li>Her iki örnek absorbans spectra 1.2.4 içinde açıklandığı gibi kaydedin. CHL 1.3.3 içinde açıklandığı gibi her iki örnekleri bir floresan emisyon spektrum kaydedin. Not: Floresans verim FCP lipozom örnek (şekil 3D ve bkz tartışma.) azalır</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig3.jpg"> Şekil 3: FCP proteoliposomes yalıtım ardından spektroskopik denetimleri ve confocal görüntüleme ekleyin. (A) FCP lipozomlar Santrifüjü sonra kurtarılması. 45 ° aralıklarla tüp açın ve hangi tüp duvara lipozomlar sopa içine dahil değil FCP toplar ise yaklaşık 1 dak - lipozomlar hareket edecek bekleyin. Absorbans spectra çözündürüldükten FCP içinde deterjan (mavi) ve FCP lipozomlar (turuncu) içinde karşılaştırılması (B) (C) (B) olduğu gibi aynı spectra chl için kırmızı bölgede maksimum normalize (~ 670 nm - Qy tepe); çözündürüldükten FCP içinde deterjan (mavi) ve FCP lipozomlar (turuncu) içinde. Büyük olasılıkla, olabilir bir pigment kaybı özellikle karotenoidler görünür 500-550 nm bölgede. FCP lipozomlar içinde kümeleme bir tepe genişletmektedir ve chl hafif bir kayma için maksimum açabilir (~ 670 nm) kırmızı. (D) emisyon spectra çözündürüldükten FCP içinde deterjan ve FCP lipozom içinde. Lipozom FCP, kümeleme floresans verim (turuncu eğri) düşürür ve emisyon maxima biraz kırmızı vardiya FCP kompleksleri enerjik etkileşimlerin geliştirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Yazarlar ifşa gerek yok.

FCP lipozomlar doğal lipid bileşimi ile spektroskopik özellikleri araştırmak için kullanışlı, basit ve tekrarlanabilir bir araç sağlamak tüp bebek. FCP lipozomlar lipid ortamında doğal koşullarına yakın olan deneysel sonuçlar için sebebiyet veren thylakoid membran içinde durum benzer.
C. meneghiniana bir modeli sistem olarak FCP anten için kullanmanın bir çok avantajı vardır. Bu nispeten hızlı büyür ve diğer diatom modeli türler ile karşılaşt...

Fotosentetik canlılar Diyatomlarla gibi sürekli değişen ışık koşulları ile başa çıkmak ve yüksek fotosentetik verimliliği sürdürmek ve aşırı ışık tarafından fotoğraf-oksidatif hasarı korumak sofistike calıştıkları mekanizmaları ile yanıt. Bir büyük ışık-koruyucu fotosentetik ökaryotlarda yüksek enerji su verme (qE) olmayan fotokimyasal su verme (NPQ) hafif stres koşulları1,2 altında ana katkısı olarak oluşur emilen ışık işlemidir ,3. Işık hasat Anten kompleksleri (LHC) uyarma enerji transferi yolları Yönetmelikte katılmaktadırlar. Yanıt yüksek ışık olarak düşük pH kloroplast lümen, anten sistem anahtarları devlet su verme durumuna hasat ışık indüklenen. Bu enerji dissipative devlet photosystems (PS) ve diğer kompleksleri thylakoid zarda fotoğraf-oksidasyon korur. Fotosentetik ökaryotlarda qE genellikle iki faktör1,2,3tarafından indüklenen. Düşük pHiçin yanıt protein hasat özel ışık bir faktördür. PsbS protein yüksek bitkiler4qE neden olmaktadır. LhcSRs5PsbS faaliyete göre modüle, neden yeşil algler6'E q. Diyatomlarla yapısal olarak LHCSRs7,8,9,10' a ilgili Lhcx gibi proteinler sahip.
İkinci qE nerede karotenoidler anten fotoğraf-koruyucu forma de-epoxidation tarafından dönüştürülür ve epoxidation tarafından yeniden dönmek xanthophyll döngüsü faktördür. Bitki ve yeşil algler, violaxanthin zeaksantin için dönüştürülür. Diyatomlarla, diadinoxanthin diatoxanthin, sonra NPQ11ölçüde ile karşılıklı olarak ilişkilendirir dönüştürülür. Bitki ve yosun LHCs ilgili evrimsel olsa anten hasat diatom ışık bazı özelliklerine sahiptir. Fotoğraf-koruma için hasat ışık geçiş son derece hızlı ve NPQ kapasitesi daha bitkiler12' ye göre. Bu neden Diyatomlarla okyanus net birincil üretim13ilâ % 45 sorumlu oldukları bir şekilde farklı ekolojik niş içinde çok başarılı bir nedeni olabilir. Bu nedenle, diatom sistemleri hasat ışık fotosentez araştırma ilginç bir nesne vardır.
Merkezli türler Cyclotella meneghiniana, thylakoid içsel ışık sistemleri sonra pigmentler adlı hasat sahip gibi Diyatomlarla - fucoxanthin, klorofil (chl) a ve c, dolayısıyla FCP proteinler, hasat ışık bağlama FCPs gibi vardır birçok membran katmandan oluşan thylakoid membran sisteminde gömülü. Diyatomlarla üç thylakoids grupları oluşturur. Bu karmaşık durum thylakoid zarda moleküler düzeyde çalışmaya zor yapar. Buna ek olarak, birçok bileşenleri (yukarı bakın) hasat ışık düzenlenmesi için katkıda bulunur. Bu nedenle, pek çok yaklaşım içinde kompleksleri gibi n-Lauryl-β-D-membran solubilize ama FCP kompleksleri sağlam tutmak maltopyranoside (β-demir), hafif deterjan kullanarak zar izole edildi. İntramolecular enerji transferi14,15,16,17araştırmak için çözündürüldükten FCP kullanarak birçok spektroskopik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Enerji transferi Yönetmeliği ile diğer Anten kompleksleri veya photosystems excitonic etkileşim ihtiyacı ancak, bu eski yaklaşım sınırlı alınmaya başlanmıştır. Kompleksleri arasındaki etkileşimi kayıp olduğu için bu nedenle, bu tür çalışmalar çözündürüldükten kompleksleri ile uygulanmaz.
Önemli bir anten Yönetmelikte "moleküler kalabalık" anten ve thylakoid membran18photosystems özelliğidir. Eskiden, basit bir yaklaşım bu etkisi simüle etmek için yapılmıştır tüp bebek. Anten kompleksleri rasgele toplama için bu da neden deterjan kaldırıldı. Her ne kadar bazı makul veri bu yaklaşım17,19tarafından elde edildi, deterjan kaldırma durumu vivo içinde yansıtmaz ve kompleksleri onların düzenli Tersiyer etkileşim değil bu yana bazı sınırlamalar vardır yapısı.
Lipozomlar kullanımı birkaç eski sınırlamalar üstesinden gelir. Üçüncül yapı hala tam olarak sağlamdır. Lipozom membran Anten kompleksleri için yarı doğal bir ortam sağlar. Membran lipozom iç dış ortamdan ayıran. Bu şekilde, lipozomlar iyon ve pH degradeleri de taşıma işlemleri gelince, çalışmalar için iki reaksiyon bölmeler sağlar. Ayrıca, deneysel sistem parametrelerini daha kolay thylakoid membran araştırmaları kontrol edilebilir. Lipozomlar zaten fotosentetik kompleksleri eğitim için mükemmel bir araç olarak gösterildi. Geçmişte büyük bir odak bitki nerede değişmiş lipid kompozisyon etkisini LHC II20üzerinde test edildi LHC oldu. Diğer yaklaşımlar, farklı LHC II arasındaki protein-protein etkileşimi incelenen21idi. Ayrıca, yeşil algler bazı çalışmalarda spontan LHC22arasında kümeleme açıklayan gerçekleştirilmiştir. Diyatomlarla sucul ekosistemler için önemi göz önüne alındığında, görece az sayıda çalışmalar Diyatomlarla Anten kompleksleri ile gerçekleştirilmiştir. İki çalışma nerede FCP anten23 ve FCP yanıt elektrokimyasal gradyan24 için kümeleme gösterildi merkezli Cyclotella meneghiniana, Anten kompleksleri araştırıldı. Böylece, lipozomlar diatom antenler ve etkileşim ve neredeyse doğal koşullar Yönetmelikte eğitim için mükemmel bir araç vardır. Lipozomlar lipid bileşimi, lipozom boyutu, protein yoğunluğu gibi birçok koşulları beri çok yönlü ve çevresindeki sulu faz kontrol edilebilir. Ayrıca, yöntem örnekleri düşük miktarda gerektirir. Deneysel sistem sağlam ve son derece tekrarlanabilir. PH eğitimi için lipozomlar compartmentalization sağlar ve önemli iyon degradeler faktörler Anten kompleksleri Yönetmelikte.
Burada, FCP Anten kompleksleri C. meneghiniana üzerinden yalıtım ve onların birleşme lipozomlar doğal thylakoid lipid bileşimi ile açıklanmaktadır. Ayrıca, çözündürüldükten FCP spektroskopik karakterizasyonu için örnek veri sağlamak ve onları lipozomlar FCP ile karşılaştırın. Yöntem bilgi ve Gundermann ve Büchel 201223, Natali vd. 201622ve Ahmed ve Dietzel 201724ilerleme--dan elde edilen standart iletişim kuralları özetler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı şematik gösterimi. (1) başvuran hücre büyüme, bozulma ve FCP ayrılık sükroz yoğunluk gradyanlar üzerinde; aşağıdaki thylakoid yalıtım tanımlayan paragraf 1 C. m. -Cyclotella meneghiniana hücreleri. (2) doğal thylakoid lipid karışımı (MGDG, DGDG ve SQDG) hazırlanması 2 ve lipid-deterjan micelles octylglycoside (OG) ile oluşturulması paragrafta açıklanan. Tanımlanmış lipid-micelle boyutu ekstrüzyon tarafından tanımlanmış gözenek çapı membranlar kullanılarak elde edilir. FCP ve lipid-micelles önceden tanımlanmış bir lipid birleştirilmiş: protein oranı ve OG ve β-DDM deterjanlar vardır FCP proteoliposomes oluşturan kontrollü kaldırılan yolu ile diyaliz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>500 ml centrifuge vials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>high speed centrifuge</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&amp;uuml;hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>newer version: Vibrogen-Zellm&amp;uuml;hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 &amp;micro;m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>VitraPOR filter funnel - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>rotor T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>&quot;6040-10-10&quot;</td><td></td></tr><tr><td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>rotor AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td>1610449</td><td></td></tr><tr><td>libre office spread sheet</td><td>The document foundation</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr><tr><td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>SDS-loading buffer Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>sonicator bath S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Nuleopore polycarbonate membrane</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>boil in destilled water before use</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbent</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotor TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;material listed in order of appearance &lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.&lt;br /&gt;Standard lab material and substances are not listed.&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Bitkiler, algler ve Diyatomlarla fotosentetik performansı güçlü ışık hasat ve enerji hızlı ve verimli regülasyonu kloroplast thylakoid membran transfer işlemlerinde bağlıdır. Diyatomlarla anteni hasat ışık, sözde fucoxanthin klorofil a/c bağlayıcı proteinler (FCP), ışık emilimi için gerekli ve fotosentetik tepki verimli transferi de fotoğraf-koruma aşırı ışık gelince merkezleri. Bu iki işlev arasında geçiş araştırma uzun zamandır devam eden bir mesele. Bu çalışmaların çoğu FCP ile deterjan micelles gerçekleştirilen. Etkileşim çalışmaları için deterjanlar, hangi FCP kompleksleri belirsiz bir toplama için yol kaldırılmıştır. Bu yaklaşım, eserler ve fizyolojik olarak ilgili verileri arasında ayırt etmek zordur. Bu nedenle, FCP ve kompleksleri hasat diğer bağlı membran ışık hakkında daha değerli bilgiler yerel lipid ortamlarındaki katıştırılmış Eğer protein-protein etkileşimleri, enerji transferi ve diğer spektroskopik özellikleri inceleyerek elde edilebilir. En büyük avantajı lipozomlar tanımlı boyutunu ve hangi tarafından FCP kümeleme ölçüde kontrol edilir bir tanımlanmış lipid/protein oranı olması. Ayrıca, in vivo hasat ışık düzenleyen pH ve iyon kompozisyon değişiklikleri kolayca benzetimi yapılabilir. Thylakoid membran ile karşılaştırıldığında lipozomlar elde edilir ve spektroskopik veri anlamak daha kolay kılan daha homojen ve daha az karmaşık. Protokol FCP yalıtım ve arıtma, lipozom hazırlık ve FCP birleşme içine lipozomlar doğal lipid bileşimi ile ilgili yordamı açıklamaktadır. Sonuçlar tipik bir uygulamadan verilen ve tartışıldı.

Protokol Cyclotella meneghiniana üzerinden toplam FCP kesir yalıtım ve birleşme lipozomlar yerli lipid bileşimi ile içine açıklar. Thylakoid yalıtım son derece tekrarlanabilir olmakla beraber thylakoid verim değişebilir. Tüm pigmentler % 50'den fazla adım 1.1.4 kazanılmaktadır kabul edilebilir bir sonucudur. % 80'den fazla en uygunudur.
Thylakoids solubilization kritik bir adımdır. Sonra adım 1.2.2 s?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

isolating-incorporating-light-harvesting-antennas-from-diatom

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

7.7K Görüntüleme.  Goethe University. Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

Video: Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biyomühendislik

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Kimya

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

<meta charset="utf8"></head><body>Aktif Fotosistem I-Işık Hasat Kompleksi I'in Bitki Dokularından Saflaştırılması

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

Aktif Fotosistem I-Işık Hasat Kompleksi I'in Bitki Dokularından Saflaştırılması

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Nörobilim

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Biyoloji

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray'ler oluşumu

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Aktif Fotosistem I-Işık Hasat Kompleksi I'in Bitki Dokularından Saflaştırılması

Aktif Fotosistem I-Işık Hasat Kompleksi I'in Bitki Dokularından Saflaştırılması

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı