Michael Heymann teşekkür ediyoruz ve Frank Siedler üretiminin silikon gofret, çekirdek tesis MPI-B için protein saflaştırma ve Simon Kretschmer yardım ve Leon Harrington el yazması üzerine yorumlar için.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz bir protokol MinCDE kendi kendine organizasyon üzerinde düzlemsel vitro sulandırma lipid bilayers desteklenen ve lipid içinde 3D yapılar, bilayer kaplı çubuk şeklinde PDMS microstructures örneği kullanarak anlatmıştık. Bu deneyleri değerli verilerini elde etmek için protein ve membran kalite kontrolü için en önemli faktörler bulunmaktadır.
Protein, protein bir kalite için kitle-var doğruladı SDS-sayfa ve kütle spektrometresi kullanılarak. Ayrıca, bu proteinler analitik jel filtrasyon veya dinamik ışık saçılma kullanarak çözünür ve değil toplanmış olduğunu doğrulanması gerekir. Jel filtrasyon proteinler toplanan herhangi bir kısmını kaldırmak için kullanılabilir. Dikkatli pH ayarlama ve eklenen nükleotit kalitesi kritik, Sigara ayarlanacağını veya kısmen bozulmuş nükleotit protein ek olarak hisse senedi veya kendiliğinden organize deneyleri protein etkinlik, bu nedenle kaldırılması ortadan kaldırmak için yeterli kendi kendine organizasyon.
Protein kalite, yanındaki membran kalite en kritik ve uygunsuz membran oluşumu en sık arızalı kendi kendine organizasyon ve artefactual yüzey yapıların kökeni için nedenidir.
Protokolü ilk kez gerçekleştirilirken, sınav-655-uyuşturucu veya dıı gibi etiketli lipidler düşük molar oranlarda (% 0.05) dahil olmak üzere tarafından desteklenen lipid bilayers etiket yararlıdır. Böylece özellikleri ve membran kalitesini doğrudan karar olabilir. Sıkı bağlamak kullanarak, membran akışkanlık tespit edilebilir. Bu yıkanmış Eğer orada da çok fazla veziküller, hiçbir sıvı membran veya hiçbir membran, olacak gibi Ayrıca, bir doğrudan SLB, yıkama kalitesini değerlendirir. Titizlikle membran, yıkamak için açık odası yaklaşım sağlar ve bu nedenle de SLB yüzeye yapışmasını veziküller kaldırmak için. Temizlik ve hydrophilicity destek yüzeyi ve doğru boyut ve SUvs polimerlerin bilayers olan sıvı ve homojen desteklenen lipid elde etmek için en önemli faktörler SUV boyutu ve boyut dağılımı kullanarak kontrol etmek yardımcı olabilir dinamik ışık saçılma. Dar boyutu dağıtımları için onları sonicating yerine veziküller yükseltme öneririz. Temizlik coverslips, Örneğin, tedavi güçlü bazlar, temel deterjanlar veya doğrudan su ile durulama sonra coverslips kullanarak diğer yöntemleri iyi, uygulama ve lipid karışımı bağlı olarak sonuçlar verebilir.
Burada, vitro sulandırma düzlemsel desteklenen lipid bilayers açık odalarında, üzerinde sunulan Protokolü ilk yarısında yüzey optik microscopies, TIRF mikroskobu gibi30, sıkı bağlamak için erişilebilir oluşturma avantajına sahiptir analiz6, tek-parçacık34yanı sıra atomik kuvvet mikroskobu26gibi yüzey araştırma teknikleri izleme. Büyük homojen alan tanımlı konsantrasyonlarda daha iyi istatistikleri sağlar. Ayrıca açık odası yaklaşım tam olarak protein konsantrasyonu ve bir hızlı ve basit ek bileşenlerinin dolayısıyla protein konsantrasyonu tek odası20titre için izin daha fazla kontrol sağlar. Tahlil FtsZ22,35, ZipA22 veya chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35gibi diğer bakteriyel divisome bileşenler tarafından genişletilebilir.
Diğer gruplar Min sistem vitro, ama kullanımı akış hücre yerine bir açık odası17,18,19başlamaktan için benzer bir yaklaşım almıştır. Akış-hücreleri belirli avantajları, özellikle gerekli18, akış17,19,23 etkisi tamamen kapalı bir 3D çevre veya membran kompozisyon23 MinCDE desenleri olduğunda var araştırdık, ya da koşullar19sınırlama protein altında uyması gereken protein desenler vardır. Yine de, yerel moleküler konsantrasyonları kontrolünü daha zordur. Protein bileşenleri, özellikle zihin, güçlü membran için bağlama karşılaştıkları ilk18,19. Deneyim, proteinler sık non-spesifik bağlama boru, giriş, şırınga ve diğer mikrosıvısal parçalar için sergi. Bu nedenle, yerel protein konsantrasyonları ve giriş konsantrasyonları18 farklı de akışı hücre gibi başkaları tarafından19farklı protein kalıpları arasındaki giriş ve çıkış, zar üzerinde çeşitli sonuçlanan, uzunluğu değişir.
Protokol yarısı burada, çubuk şeklinde microstructures lipid tarafından örtülü bir desenli desteği üzerinde açık odası yaklaşımı yeniden kullanarak vitro rekonstitüsyon sunulan ikinci bilayers sağlar vivo içinde protein davranış basit bir taklit için protein konsantrasyonları üzerinde kesin denetim arabellek kaldırma nedeniyle kayıp olmasına rağmen. Dalga boyu fayans bir büyüklük sırasında olduğundan daha büyük vitro vivo içinde daha çubuk şeklinde microcompartments vardır bir büyüklük daha büyük (10 x 30 µm) bir çubuk şeklinde E. coli daha hakkında da hücre olduğunu unutmayın.
Genel olarak, bu iletişim kuralı protein konsantrasyonu, arabellek oluşturma ve membran özellikleri dahil olmak üzere tüm koşullar hassas kontrol için izin verir. 3D yapılandırılmış destekler kullanımı kayma hapsi, in vivo davranış karmaşık Havacilik ekipman için gerek kalmadan taklit altında incelenecektir tepki sağlar.

Zamanmekansal desenleri doğada çok hücreli ve hücresel düzeyde, morfogenez düzenlenmiş hücre bölünmesi1,2üzerinden her iki karmaşık görevleri düzenleyen temel alır. Tepki-difüzyon sistemleri bu kalıpları kurulmasında önemli bir rol oynamaktadır, ama hala iyi anlaşılır. Başlıca örneklerinden bir tepki-difüzyon ve en iyi karakterize biyolojik sistemleri defa Escherichia coli MinCDE sistem3,4,5,6,7biridir. MinCDE sistemi gelecek bölümü site olarak hücre ortasına belirlemek için E. coli Kutbunda hücre için hücre Kutbu'ndan olsun. Bu sistem ATPaz zihin, benim ve kayma tepki matris8olarak membran protein aktive ATPaz dayanmaktadır. MinC desen oluşumu mekanizmasının bir parçası değil, ama gerçek fonksiyonel aracı: bir inhibitörü ana divisome protein FtsZ5,6. MinC akla bağlar ve bu nedenle salınım hücre kutuplarda maksimal ve hücrenin ortasında, en az bir saat ortalama olarak protein konsantrasyonu degrade sonuçlanan sadece FtsZ midcell9,10 polimerize izin izler . MinCDE sistem bakteri2, kronolojik zamanmekansal kuruluşta hücre düzenleme ve konumlandırma ve protein kompleksleri11 ve plazmidlerin12 taşınması için anahtarıdır Walker A ATPases daha büyük ailesinin bir parçasıdır bölümü13 kromozom segregasyon ve14. Dolayısıyla, MinCDE tepki-difüzyon sistem sadece bir arketipik tepki-difüzyon sistemini temsil eder, ama aynı zamanda bakteri kronolojik zamanmekansal kuruluşta için önemi nedeniyle dikkat çekti.
Genellikle protein ve gen silme manipülasyon sonucu olarak hücre bölünmesi kusur MinCDE sistemi içinde vivo detaylı fonksiyonel çalışmaları karmaşıktır. Ayrıca, membran kompozisyon veya sitozol in vivo özelliklerinin çok zorlu değişiyor15,16. Sistem ve faktörler etkileyen değişiklikler içinde önemli bir işlevi hücre bölünmesi olarak rahatsız ettiysem cep karmaşık ortamı içinde daha çok yorumlamak zordur. Biz ve diğerleri bu nedenle bir vitro sulandırma yaklaşım, sistemin çekirdek bileşenlerinin azaltarak çevirdiler: zihin, benim, bir enerji kaynağı olarak ATP ve desteklenen lipid bilayer bir reaksiyon matris6,17, olarak 18. bir yaşam hücrenin ayrıntılı Karmaşıklık olmadan kendi kendine organizasyon mekanizmasının soruşturma için bu tabandan tavana bir yaklaşım sağlar. Genellikle bir büyüklük vivo içindebüyük hakkında böyle bir dalga boyu ile de olsa yüzey seyahat proteinler formu6 ve desenler17,19 bu koşullar altında diğer tür dalgalar. Desen oluşumu etkileyen tüm yönleri üzerinde tam denetim bir açık odası kullanımı kolaylaştırır: protein konsantrasyonları6, protein özellikleri20, membran kompozisyon10, arabellek oluşturma ve ATP konsantrasyonu 6yanı sıra ajanlar21 ve diğer divisome proteinler22kalabalık gibi diğer faktörler eklenmesi. Buna karşılık, bir akış hücreli18,19,23 MinCDE sisteminde vitro sulandırma akışı17,23, protein etkisini araştırmak için kullanılabilir Sınırlayıcı koşullar19, membran kompozisyon19 ve tam 3D doğumdan18 protein desenleri, ama tam bir denetim protein/bileşen konsantrasyon ve sıralı bileşen ek çok daha karmaşık işler.
Bu açık odası kullanarak, aynı zamanda hangi tarafından bir nasıl geometrik sınırları etkisi desen oluşumu21, son zamanlarda bir fenomen sonda düzlemsel lipid bilayers destek desenli de incelenen vivo içinde bakteri kullanarak microstructures7kalıplanmış. Ayrıca benim nasıl tanımlanmış mutasyonların araştırmak için bu tahlil etkiler desen oluşumu sistem20çalıştırmaya başladık. Ayrıca, aynı temel tahlil biçimi nasıl desen oluşumu bir azobenzene-çapraz mayın peptid tahlil içine tanıtımı ve TIRF mikroskobu24ile düşsel ışık tarafından kontrol edilebilir araştırmak için istihdam edilmiştir.
Fayans modeli çoğaltmak için oluşumu vivo vitro sistem, doğumdan anahtardı gözlenen, bulduk. Desteklenen lipid bilayer ile kaplı büyük dalga boyu fayans vitro (10 x 30 µm) için ayarlanmış boyutları ile microcompartments, çubuk şeklinde kullanarak sulandırma fayans pole pole salınımlar ve protein degrade oluşumu izin 10,25. Bu tahlil desteklenen lipid bilayers üstündeki açık kalan çubuk şeklinde microcompartments birkaç yüz çoğaltmalarını içerir desenli PDMS substrat üzerine yatırılır. Bu, açık bir odasında tepki ayarlanabilir ve daha sonra arabellek microcompartments, böylece küçük bir birim için tepki hapsetmesi RIM için indirilir. Olsa bile bu bölmeleri bir tarafta bir hava-tampon arabirimi ve bu nedenle bir tam 3D doğumdan membran tarafından temsil etmemektedir, protein dynamics in vivo salınımlarını10,25taklit. Tam 3D hapsi için karşılaştırıldığında, çok benzer gösteren18sonuçlar, açık microstructures tahlil nispeten basit ve kolay işlemek ve özel Havacilik ekipman ile donatılmış değil laboratuvarlar tarafından da gerçekleştirilebilir ve Temiz Oda imkanları.
Burada, MinCDE desen oluşumu için tüm bileşenleri ve kolay erişim denetimi tarafından optik mikroskobu ve minor ile sağlar bir açık odası kullanarak lipid bilayers vitro desteklenen başlamaktan için deneysel bir protokol mevcut değişiklikler, aynı zamanda yüzey-soruşturma teknikleri26için adapte olduğunu. Düzlemsel desteklenen lipid bilayers yanında, biz de ne kadar protein hapsi olabilir göstermek basit desenli desteklenen lipid bilayers PDMS microstructures çubuk şeklinde kullanarak elde. Bu deneyleri MinCDE sistemi için en iyi duruma getirilmiş olsa da ayrıca FtsZ27 veya en az aktin korteks28gibi membran ile benzer bir şekilde etkileşim diğer protein sistemlerine aktarılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Hücreleri temel kronolojik zamanmekansal organizasyonu, bir çok yönünü tepki-difüzyon türü sistemleri tarafından yönetilir. Vitro sulandırma böyle sistemleri sağlar mümkün olmaz onların temel mekanizmaları ayrıntılı çalışmalar için içinde vivo. Burada, hangi hücrenin ortasında hücre bölünmesi septum konumlandırır Escherichia coli, MinCDE sisteminin vitro sulandırma için bir protokol sağlar. Tahlil sadece kendi kendine organizasyon için gereken bileşenleri yani bir membran iki protein zihin ve maden ve enerji ATP şeklinde sağlamak için tasarlanmıştır. Bu nedenle bir açık tepki odası üzerinde desteklenen lipid bilayer kuruldu bir coverslip imal. Açık tasarım odasının lipid bilayer en uygun hazırlanması ve toplu içerik kontrollü manipülasyon sağlar. İki protein, zihin ve benim yanı sıra ATP, sonra membran üzerinde toplu cilt içine eklenir. Görüntüleme TIRF mikroskobu hem ve tasarım destekler confocal, geniş alanlı olarak birçok optik microscopies mümkündür. Protokol bir varyasyon lipid bilayer desenli bir desteğinde PDMS microstructures hücre şeklinde cam yerine üzerinde oluşturulur. Bu bölmeler kenarında toplu çözüm düşürücü tepki daha küçük bir kompartımanda içine alır ve in vivo salınım davranışını taklit izin sınırları sağlar. Birlikte ele alındığında, biz MinCDE sistemi ile ve kayma hapsi, olmadan reconstitute için protokolleri araştırmacılar tam konsantrasyon aralıkları ve diğer faktörler eklenmesi gibi desen oluşumu etkileyen tüm özelliklerini yönetmeniz için izin tarif ya da proteinler ve sistematik olarak nispeten basit deneysel ayarı sistem karmaşıklığı artırmak için.

Bizim protokol sonrası protein saflaştırma Min proteinler yeterli saflık verim. Bir referans olarak, zihin, zihin, benim ve MinC fluorescently etiketli SDS-sayfa görüntüsünü resim 1 sağlar. Fayans kendi kendine organizasyon tahlil desteklenen lipid sigara desenli bilayers üzerinde gerçekleştirmek için yordam tek tek adımları Şekil 2' de açıklanmıştır. Bu iletişim kuralını kullanan, düzenli fayans yüzey dalgaları seyahat odası (Şekil 3) görülebilir. Dalga boyunu biraz odası içinde değişir, ancak genel olarak desen benzer. (Bkz. Şekil 3 c) UV tutkal formunda cama daha farklı özellikleri var gibi membran yüzey gibi odası kenarlarını nicel karşılaştırmalar için kullanılmamalıdır. Seyahat yüzey dalgaları yayılma yönünde (Şekil 3B) boyunca yoğunluk komplo tarafından çözümlenebilir. Floresans yaylalar oldukça hızlı öncü--dan belgili tanımlık sallamak ve keskin firar kenarında azalır unutmayın, maden floresans zihin dalga başından beri hemen hemen doğrusal olarak artar ve onun en büyük zihin sonra firar kenarında eriştiği nerede o belirgin6düşüyor.
Protein kalitesi yanında, desteklenen lipid bilayers kalitesini en MinCDE bir düzenli kendi kendine organizasyon için önemlidir. Bir yandan membran çok aşırı derecede yıkanır veya temel yüzey temizlenir ve böylece güçlü kullanılıyorsa, membran içinde delikler oluşabilir (Şekil 6A, üst). Öte yandan membran düzgün yıkanmış değil veya temel yüzey temizliği/hydrophilized değil, veziküller membran için sopa veya membran akışkanlık tehlikeye girer (Şekil 6A, alt). Düz-se bile değil gibi belirgin gibi membran etiketli lipidler üzerinden doğrudan gözlem zaman, bu sorunların da zihin floresans sinyalini gibi desenleri değil düzenli ve floresan maxima içinde homojen değil ama "delik" içerir tespit edilebilir veya parlak noktalar Şekil 6Aorta masası gösterildiği gibi.
Çubuk şeklinde PDMS microstructures içinde fayans kendi kendine organizasyon için yordamı Şekil 4' te özetlenmiştir. Proteinler ve yağlar yeniden kullanılabilir gibi düzenli olarak yapılmasını planlamıştı, birkaç protokol adımları uygulamanız gerekmez. Sigara desenli yüzeyler üzerinde yüzey temizlenir ve (plazma temizleme tarafından) hydrophilized, desteklenen lipid bilayer PDMS üzerinde oluşturulur ve kendi kendine organizasyon tahlil 200 µL hacmindeki kurmak gibi. Uygun bir membran oluşturmuştur ve fayans membran üzerinde kendi kendini düzenler denetlemek için odaları görüntüsü. Uygun bir membran yüzey dalgaları arasında bireysel microstructures PDMS yüzeyinde düzenli seyahat fayans formlar oluşturulmuştur ve dalgalar serbestçe mümkün olduğunca da microstructures alt kısmında kendi kendine organize zaman tüm hareket membran kaplı yüzey (Şekil 5A). Tamamen kuru olmalıdır arabellek kaldırıldıktan sonra yüzey bölmeleri arasında herhangi bir yayılıyor fayans modelleri (5B rakam), gösterecektir değil. Fayans modelleri hala hareket ediyor, daha fazla arabellek kaldırılması gerekiyor. Proteinler şimdi çubuk şeklinde microcompartments membran kaplı PDMS ve hava üst arabirimde hangi onlar kendi kendine organize edecek (Şekil 5C) tarafından sınırlı. Bu koşullar altında iki protein Şekil 5 diçinde gösterildiği gibi kutup kutup salınım gerçekleştirebilir. Bir kısmını zihin ve benim her zaman membran bağlı olduğu gibi Ayrıca arabellek kaldırma sırasında arabellek çıkarıldıktan sonra konsantrasyonları konsantrasyonları giriş için karşılaştırılabilir değildir. Arabellek kaldırma önce desen konumunu bağlı olarak bu etkisi nedeniyle konsantrasyonları arasındaki bireysel microstructures aynı coverslip üzerinde de değişir. Silikon Gofret üretim veya PDMS kalıplama silikon gofret üzerinden analiz (Şekil 6B) için kullanılamaz eksik microstructures neden olabilir. Ayrıca, arabellek nedeniyle kaldırma microstructures işlemi sırasında kuru ve bu nedenle, daha fazla çözümleme (Şekil 6B) tutulmalıdır. Sonuç olarak microstructures bir odasında sadece bir kısmını istenen pole pole salınımlar gösterir. Microstructures protein dinamiklerini analiz etmek için bir kymograph tüm yapısı (Şekil 5E) üzerinde bir seçim çizerek elde edilebilir. MinCDE salınım pole pole, MinC ve zihin zaman ortalama bir konsantrasyon gradyan yuvası kutuplarda maksimum konsantrasyon ve en az konsantrasyon ile bölme (Şekil 5F) ortasında gösterecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Şekil 1: SDS-sayfa protein purifications nihai ürünler gösteriliyor. O'nun-zihin (33.3 kDa), O'nun-eGFP-US (60.1 kDa), O'nun-mRuby3-US (59.9 kDa), O'nun-MinE (13,9 kDa) ve O'nun MinC (28,3 kDa) sırada gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Şekil 2: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama üzerinde desteklenen lipid sigara desenli bilayers (adım 1-6) kendi kendine bir organizasyon için protokolün. Kesikli kutuları şu iki seçenekten birini temizlemek için kullanılabilir gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Şekil 3: fayans tahlil tarafından confocal mikroskobu Imaging. A) düzenli Min sarmal, hangi dalga yayılma hızı, yoğunluk arsa ve hız ölçümleri elde edilebilir. Kullanılan konsantrasyonları: 0.6 µM, zihin (% 30 eGFP-MinD) 1.8 O'nun µM madeni (% 30 O'nun-maden-Alexa647) B) örnek normalleştirilmiş yoğunluğu Arsa bölge için işaretlenmiş A'ya C) tüm tahlil odası genel bakış (ölçek çubuğu: 1 mm, olarak aynı protein konsantrasyonları yukarıda). Her iki yönde de hedef desenler görülebilir dönüm spiraller. Büyütülmüş bölgesi nasıl dalga kalıpları UV uyuşmuşhalde farklılık gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Şekil 4: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama çubuk şeklinde microstructures (adım 1-5, 7, 8) içinde kendi kendine organizasyon için protokolün. Gri kutuları nereye ürünleri yeniden kullanılabilir merdivenlerinde protokolü üzerinden desteklenen lipid sigara desenli bilayers gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Şekil 5: fayans için temsil edici sonuçlar desen çubuk şeklinde PDMS microcompartments oluşumu. A) fayans kendi kendine organize yüzey dalgaları seyahat oluşturan PDMS yüzeyinde (1 µM MinD (% 30 EGFP-zihin), 2 µM benim ve 2.5 mM ATP). B) sonra arabellek microstructures yüksekliğe indirilir, protein kendi kendine organizasyon düzlemsel yüzey microcompartments arasında durur. C) şematik bir çubuk şeklinde microcompartment. D) fayans pole pole salınımlarını arabellek çıkarıldıktan sonra temsilcisi görüntüler. E) D içinde gösterilen vurgulanan hattı boyunca titreşimler Kymograph). F) görüntü ve profil-serisi D içinde gösterildiği zaman ortalama floresans yoğunluk) açıkça maksimal microcompartment Polonyalılar ve bölme orta, en az protein degrade gösterilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Şekil 6: negatif deneysel sonuçlar örnekleri. A) aşırı yıkanmış membranlar birikir delik, suboptimal. sivilce ürünleri ve lipit kompozisyonları veziküller yapışmasını için kurşun iken. İki merkezi panelleri sorunları ve nasıl onlar Min salınımlarını gözlemleyerek zaman görünür hale gelir bir arada göstermek. Membranlar ile % 0.05 etiketli Atto655-DOPE. (ölçek çubukları: 50 µm) B) üst panel: kurudu microcompartments çok fazla arabellek kaldırma veya arabellek zaman içinde buharlaşır neden olabilir. Alt paneli: eksik bölmeleri Gofret üretim veya PDMS döküm sırasında oluşmuş. (ölçek çubukları: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1: Plazmid harita onun zihin için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 2: Plazmid harita His-EGFP-US için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 3: Plazmid harita His-mRuby3-US için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 4: Plazmid harita benim onun için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 5: Plazmid harita MinC onun için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 6: Microcompartments çubuk şeklinde silikon gofret için CAD dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biochemistry. Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Video: In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an enormous amount of spectra, setting challenges for quality control of the mass spectrometry spectra. To reduce the false positives, false discovery rate (FDR) quality control is necessary. Recently, we developed a software for FDR control of untargeted metabolome identification that is based on a Target-Decoy strategy named XY-Meta. Here, we demonstrated a complete analysis pipeline that integrates XY-Meta and metaX together. This protocol shows how to use XY-meta to generate a decoy database from an existing reference database and perform FDR control using the Target-Decoy strategy for large-scale metabolome identification on an open-access dataset. The differential analysis and metabolites annotation were performed after running metaX for metabolites peaks detection and quantitation. In order to help more researchers, we also developed a user-friendly cloud-based analysis platform for these analyses, without the need for bioinformatics skills or any computer languages.

We constructed an untargeted metabolomic workflow that integrated XY-Meta and metaX together. In this protocol, we displayed how to use XY-Meta to generate a decoy spectral library from open access spectra reference, and then performed FDR control and used the metaX to quantitate the metabolites after identifying the metabolomics spectra.

FDR Kontrol Tabanlı Hedefsiz Metabolom Üzerinde Entegre Bir Tanımlama ve Niceleme İş Akışı

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...