OLA, sentetik biyoloji topluluğu için yararlı olan çok yönlü bir mikroakışkan platformdur. özellikle, yapay hücrelerin biyomühendisliğine. OLA bazlı lipozomlar, biyolojideki öz-organizasyon ilkelerini anlamamıza ve hücre taklit eden meclisler oluşturmamıza yardımcı olabilir.
OLA, monodispersed, unilaminar, hücre boyutunda lipozomları yüksek verimli bir şekilde ve mükemmel bir kapsülleme verimliliği ile üretir. 50 mikrolitre mertebesinde çok küçük numune hacimleri gerektirir ve oluşan lipozomlar daha fazla çip üzerinde deney için hemen kullanılabilir. OLA, mikro sınırlamalar, vezikül dinamikleri ve biyomoleküler kondensatlar içindeki biyolojik reaksiyonları ve bunların membranlarla etkileşimlerini incelemek için yararlıdır.
OLA ayrıca, örneğin antimikrobiyallerin geçirgenliğini ve membranik aktivitesini test etmek için ilaç taraması için yüksek verimli bir platform olarak da uygulanmıştır. PV işlemi olan yüzey fonksiyonelleştirme, protokol için kritik bir adımdır ve PV çözeltisinin iç aquea ve lipit taşıyan organik kanallara girmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yapılması gerekir. Ayrıca, post-prodüksiyon kanalı, oktanol ceplerinin ayrılmasının lipozomlar oluşturması için yeterince uzun olmalıdır.
Laboratuvarımdan doktora öğrencisi Ketan Ganar, Chang Chen'in prosedürü göstermesine yardımcı olacak. Başlamak için, dört inç çapında temiz bir silikon gofret alın ve toz parçacıklarını gidermek için basınçlı hava kullanarak daha da temizleyin. Gofreti bir spin kaplayıcı üzerine monte edin ve gofret ortasına yaklaşık beş mililitre negatif fotorezisti yavaşça dağıtın.
10 mikrometre kalınlığında bir fotorezistli tabaka elde etmek için, spin kat ayarlarını ilk yayılma için saniyede 100 RRP ivmelenme ile 30 saniye boyunca 500 RPM'ye ayarlayın, ardından saniyede 500 RPM ivmelenme ile 3.000 RPM'de 60 saniyelik bir dönüş yapın. Ardından, gofreti döndürün. Gofreti bir ısıtma plakasında 65 santigrat derecede iki dakika ve daha sonra 95 santigrat derecede beş dakika pişirin.
Gofret soğuduktan sonra, gofreti doğrudan sağ optik litografi makinesinin baskı odasına monte edin ve oktanol destekli lipozom tertibatını veya OLA tasarımını yazılıma besleyin. Tasarım basıldıktan sonra, gofreti bir dakika boyunca 65 santigrat derecede, ardından üç dakika boyunca 95 santigrat derecede pişirin. Kürlenmemiş fotodirenci yıkamak için, gofreti kürlenmemiş fotodirenç tamamen çıkarılana kadar geliştirici çözeltisini içeren bir cam beher içine batırın.
Basılı tasarımın gofret yüzeyine sıkıca tutturulduğundan ve çıkış yönündeki imalat sürecinde çıkmadığından emin olmak için gofreti 150 santigrat derecede 30 dakika boyunca sert bir şekilde pişirin. Mikroakışkan cihazı hazırlamak için, ana gofreti kare bir alüminyum parçasına yerleştirin ve alüminyum folyoyu gofret etrafına sararak iyi bir yapı oluşturun. PDMS karışımını yavaşça ana gofret üzerine dökün.
Montajı en az iki saat boyunca 70 santigrat derecede bir fırında inkübe edin. Ana gofreti fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. Katılaştırılmış polidimetilsiloksan veya PDMS bloğunu çıkarmak için, alüminyum folyoyu çıkarın ve ardından PDMS bloğunu gofret kenarından dikkatlice çıkarın.
Şeffaf bir cam kapak fişi alın, cam slaytın ortasına yaklaşık 0,5 mililitre PDMS dökün ve cam slaytı hafifçe eğerek kapak kayması boyunca yayın, böylece cam slaytın PDMS ile tamamen kaplanmasını sağlayın. Cam sürgüyü sıkma kaplayıcısına monte edin. Kızağın ortası basınç milinin merkezi ile örtüşecek şekilde merkezi olarak yerleştirildiğinden emin olun.
Ardından, cam sürgüyü saniyede 100 RPM artışla 15 saniye boyunca 500 RPM'de ve saniyede 500 RPM'lik bir artışla 30 saniye boyunca 1.000 RPM'de döndürün. PDM kaplı cam sürgüyü, kaplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde, kapalı bir Petri kabındaki PDMS bloğu gibi yükseltilmiş bir platforma yerleştirin. İki saat boyunca 70 santigrat derecede pişirin.
PDMS bloğunu, oyulmuş kanallar yukarı bakacak şekilde ve PDM kaplı cam sürgüsünü, kaplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde plazma temizleyicinin vakum odasına yerleştirin. Vakumu açın ve yüzeyleri etkinleştirmek için içeriği 15 saniye boyunca 12 megahertz radyo frekansında hava plazmasına maruz bırakın. Oksijen plazması pembemsi bir renk tonu şeklinde görülebilir.
Plazma işleminden hemen sonra, PDMS kaplı cam slaydı PDMS tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin. PDMS bloğunu, mikroakışkan desen şimdi PDMS kaplı cam kızağa bakacak şekilde yavaşça yerleştirin ve yapışmalarını sağlayın. Yapıştırılmış cihazları iki saat boyunca 70 santigrat derecede pişirin.
200 mikrolitre% 5 polivinil alkol veya OVA çözeltisini 1,5 mililitrelik bir tüpe dağıtın ve mikroakışkan rezervuar standına bağlayın. Boruyu, bir ucu PVA çözeltisine batırılacak ve diğer ucu mikroakışkan cihazın dış sulu kanalının girişine bağlanacak şekilde yerleştirin. PVA çözeltisini dış sulu kanallarda akıtmak için dış sulu fazın basıncını 100 milibara yükseltin.
PVA çözeltisinin bu kanallar içindeki geri akışını önlemek için iç sulu ve lipit taşıyan organik fazların basınçlarını 120 milibara yükseltin. PVA çözeltisini yaklaşık beş dakika boyunca bu şekilde akıtarak çıkış kanalının tam olarak çalışmasını sağlayın. PVA çözeltisini çıkarmak için lipit taşıyan organik ve iç sulu kanallardaki basıncı iki bara yükseltin ve boruyu hemen dış sulu girişten ayırın.
Aynı zamanda, çıkış kanalından fazla PVA'yı çıkarmak için negatif basınç kanalına bağlı bir boru kullanın. Cihazı 120 santigrat derecede 15 dakika pişirin ve kullanmadan önce soğumaya bırakın. Cihaz ortam koşullarında en az bir ay saklanabilir.
Çözeltileri üç adet 1,5 mililitrelik tüpe dağıtın ve bunları birleştirin. Bunları PVA ile muamele edilmiş mikroakışkan çipe bağlayın ve üç kanala, iç sulu ve lipit taşıyan organik kanallarda yaklaşık 100 milibar ve dış sulu kanalda yaklaşık 200 milibar pozitif basınç uygulayın. Her üç faz da kavşakta birlikte akmaya başladığında, çift emülsiyon üretiminin başladığından emin olun ve basıncı kalitesine göre ayarlayın.
Çift emülsiyon damlacıkları akarken, oktanol tüm cepler giderek daha belirgin hale gelir ve sonunda lipozomlar oluşturarak sıkışır. Çift emülsiyon damlacıklarının hızlı oluşumunun parlak alan görüntüsü burada gösterilmektedir. Floresan lipit kanalı, kısmi de-wetting nedeniyle tüm cebinde bir oktanol oluşumunu gösterir.
İç sulu kanal, sarı floresan proteininin kapsüllenmesini gösterir. Lipozom oluşturan çıkış kanalındaki oktanol cebinin ıslanması bu şekilde gösterilmiştir. Bu görüntü, lipozom içinde kapsüllenmiş homojen polilizin ve ATP çözeltisinin fazla ayrılmış polilizin ATP koakervatlarına pH bağımlı geçişinin şemasını temsil etmektedir.
Lipozomdaki ilk asidik ortam, ATP'nin moleküler yükünü nötr hale getirir ve koaservasyonu inhibe eder. Lipozomların içindeki pH, dışarıdan uygulanan pH artışı ile dengelendiğinde, ATP negatif bir yük kazanır ve koaservasyonu tetikler. Polilizin ve membranın uzamsal dağılımı ve lipozomlar içindeki polilizin ATP coacervates oluşumunun zaman atlamalı görüntüleri bu şekilde gösterilmiştir.
Temel bir tamponun harici baskısı, lipozomların içindeki pH seviyesini dakikalar boyunca yükseltir ve koaservasyonu başlatır. T, sıfır dakikaya eşittir, ilk coacervation olayının meydana gelmesinden hemen önceki zamanı ifade eder. Prosedürü gösterirken, sabit bir çift emülsiyon üretimi oluşturmak için kanal basıncını sabırla ayarlamak çok önemlidir.
OLA ve varyasyonları, biyomoleküler kondensatların dinamiklerini, proteinin hücresiz ekspresyonunu ve bakterilerin kapsüllenmesini anlayan lipozomların büyümesi ve bölünmesi gibi çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu yüzden kontüzyonda, OLA'nın sentetik biyoloji için çok yönlü bir platform olduğuna inanıyoruz.
