1. klonlama ve hücre satırı üretimi
<ol><li>PCR yükseltmek NBB bölge çerçeve standart Restriksiyon enzimi tabanlı Oligomerizasyonda etki alanı 2 x FK506 bağlayıcı protein (2xFKBP veya 2xFV) ve Venüs floresan ile klonlama olarak amino asit kalıntıları eklenmesi 1-140 (NBB140), insan MLKL cDNA sayfasından için karşılık gelen protein doksisiklin (Dox) - indüklenebilir retroviral vektör pRetroX-NBB140elde etmek için TRE3G - 2xFV-Venüs (Tablo 1, rakamlar 1A-B).</li>
	<li>Ölümsüzleştirmek SV40 büyük antijen ile geçici transfection tarafından ilgili fareler yeşil laboratuarda elde edilen birincil mlkl- / - veya ripk3- / - mlkl- / - fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) Plazmid ifade ediyorum. ~ 1 – 2 ile ölümsüzleştirdi hücreleri seçin hafta ve % 10 fetal Sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate ve 37 ° C ve % 5 CO2 standart doku'de gerekli olmayan amino asitler ile takıma DMEM korumak Kültür İnkübatörler.</li>
	<li>Transduce SV40 ölümsüzleştirilmiş mlkl- / - MEFs ile ters tetrasiklin kontrol transactivator (rtTA)-retrovirüsü blasticidin direnç gen (bizim değiştirilmiş plazmid) içeren bir plazmid ifade içeren ve 1 için tedavi hafta ile 5 μg/mL blasticidin stabil rtTA28ifade hücrelerini seçer.</li>
	<li>RtTA ifade MEFs ile Dox indüklenebilir retroviral vektör chimeric MLKL içeren transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-Venüs-puro) ve bir hafta, 2 gün sonra iletim için 4 μg/mL puromisindir kullanarak seçin.</li>
</ol>2. canlı cep mikroskobu görüntüleme Necroptosis MLKL-aracılı
<ol><li>Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-24 (1 mL/de) kuyuya başına 50.000 hücre yoğunluğu, Venüs de tabak ve gecede kuluçkaya (Şekil 2A). (Bkz. Tablo reçetesi) otomatik hücre sayımı için canlı hücre boyama kullanın.</li>
	<li>Hücreler Dox ile 12 h için tedavi (0.5 μg/NBB140ifade ikna etmek için mL)-2xFV-Venüs.</li>
	<li>Necroptosis 25 nM FKBP dimerizer (Dim) ile 25 nM membran geçirimsiz yeşil floresan yanı sıra teşvik ( Tablo malzemelerigörmek) standart DMEM boya (1.2 bakın). Necroptosis geçiren hücreleri birikir boya NBB140tarafından onların plazma membran bütünlüğü tehlikeye gibi-aracılı yırtılması. Deneyleri nüsha veya quadruplicate yerine getirmek.</li>
	<li>Tek veya çift renkli görüntüleme sistemleri ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak necroptosis izlemek için bir memeli doku kültürü kuluçka makinesine yer alan ilgili görüntüleme birimi damarları yerleştirin.</li>
	<li>Açık bilgisayar yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek) ve zamanlama yaklaşan tarar görevler listesinin altında sekmesini seçin. Not: bu iletişim kuralı tek renkli sistemleri kullanarak görüntüleme için ama benzer bir yazılım çift renkli sistemlerinde kullanılabilir.</li>
	<li>"Tepsi, gemi, tarama türleri" ve "Tarama deseni" "Fiziksel düzeni" sekmesini ve "Hızlı floresan" Özellikler sekmesini seçin.</li>
	<li>"İnceden inceye gözden geçirmek yanında tıkırtı zaman" "Zaman çizelgesi" pencere ve toplam zaman puan ve frekans Alım (genellikle 1 edinme her 0,5 h 6 12 h s veya fast-kinetik necroptosis için her 5 dk 1 h) ekleyin ve resim alma "App seçerek başlayın ly"(kırmızı düğme).</li>
	<li>Görüntü analiz yazılımı kullanarak necroptosis ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) seçerek "görev bölmesinden", "Nesne sayma yeni analizi ile sabit segmentasyon eşik arka plan seviyesinden", hangi tespit üzerine gelerek fare imlecini birkaç görüntü analizinde kullanılan bölgelerde arka plan üzerinde.</li>
	<li>Geçerli görüntü kullanarak önizlemesini görüntülemek seçerek floresan nesneleri inceleyin ve gerektiği gibi eşit düzeylerine rafine.</li>
	<li>Yeşil floresans sayar "Denize indirmek yeni analiz" sekmesini açarak entegre, "Zaman aralığı" seçmek, çözümlenmesi, "Analiz iş adı" girin ve "Tamam" tuşuna basarak için kuyu seçin.</li>
	<li>Erişim ilgili işin adına çift tıklatıp ek çözümleme harici grafik yazılım grafik/verme penceresinden verme "Analiz işleri" sekmesinden veri analiz ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Veri yeşil floresans pozitif (+ ve) olarak sayar/mm2 quantitate veya sayıları izdiham tarafından normale ve verileri hızlı yeşil floresans + ve sayıları/izdiham olarak.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, deneysel uç noktada 100 hücrelerle leke membran-permeant yeşil floresan nM boya ( Tablo malzemelerigörmek). Yeşil floresans/yeşil floresans uç noktada oranı % necroptotic hücrelere veri normalleştirmek.</li>
</ol>3. canlı hücre Confocal mikroskobu görüntüleme plazma zarı işe alım ve Permeabilization MLKL tarafından
<ol><li>Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-Venüs bir cam (0.5 mL/de) kuyuya başına 20.000 hücre yoğunluğu, alt için 30 dk 37 ° C'de PBS içinde 50 µg/mL fibronektin ile ön işleme 4-şey mikroskobu odası ve ~ 12 h ( için kuluçkaya Şekil 2B).</li>
	<li>Dox hücrelerle tedavi (0.5 μg/mL) ~ 12 h NBB140ifade ikna etmek için-2xFV-Venüs.</li>
	<li>Necroptosis taze orta ile 25 (1 mL/de) kuluçka tarafından teşvik nM NBB140ikna etmek için Dim-2xFV-Venüs harekete geçirmek ve plazma zarı için translocation.</li>
	<li>Çevre denetimi ve bir 63 ile donatılmış bir ters stand üzerinde inşa confocal mikroskobu tarama dönen disk lazer odası yerleştirin 1.4 NA amaç ve yazılım kullanarak edinme Imaging başlar ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı başlatmak, YFP filtre yapılandırma (uyarma dalga boyu 515 nm) ve "Focus" simgesini seçin.</li>
	<li>Görüş alanı ve odak düzlemi bulun ve "Kesin Focus" sekmesini kullanarak odak bakım sistem meşgul.</li>
	<li>Satın alma başlamak için filtre yapılandırma, uygun EMCCD fotoğraf makinesi pozlama zaman ve yoğunlaştırılması kazanç ve hızlandırılmış edinme parametrelerini aralığı ve edinme uzunluğu gibi atama tarafından takip "Yakalama" sekmesini seçin.</li>
	<li>İzlemek floresan NBB140hücresel yeniden dağıtım-2xFV-Venüs protein elde tarafından necroptosis sırasında görüntüleri her 10 515 nm lazer (Film 1) kullanarak bir EMCCD kamera tarafından s. Not: Photobleaching floresan protein görüntüleme ile bir husustur. Venüs daha dayanıklı floresan proteinler photobleaching29biridir. Photobleaching için daha duyarlı floresan proteinler kullandıysanız, her 30 resim s veya kurtarma görüntüleme zaman puan arasında sinyal sağlamak için daha uzun.</li>
	<li>NBB140Derneği plazma zarı izlemek için-2xFV-Venus necroptosis sırasında görüntü her 10 s örnek hazırlanan 3.3 içinde toplam iç yansıma floresans tarafından bir otomatik TIRF slider ile donatılmış bir mikroskop kullanarak (TIRF) mikroskopi ve bir 100 x 1.4 NA objektif ve bir EMCCD kamera (Movie 2). 3.5-3.7, adımları izleyin ama TIRF odak sekme mikroskobu odası örnek ve alt cam kalınlığı göre içindeki TIRF açısını ayarlamak. Not: plazma zarı işaretleyicileri LCK-C-RFP gibi denetimleri plazma zarı yerelleştirme TIRF analizi için kullanılabilir.</li>
	<li>Görüntü kalitesi Gauss işlev (Marr algoritması) negatif normalleştirilmiş ikinci türev ile evrişim tarafından geliştirmek için işleme gerçekleştirin.</li>
</ol>4. elektron mikroskobu
<ol><li>Plaka mlkl- / - NBB140ifade MEFs-2xFV-Venüs bir yoğunluk plazma kaplı 150 mm 5 milyon hücre, hücre kültür çanak ve kuluçkaya 12 h (Şekil 3).</li>
	<li>Doksisiklin hücrelerle tedavi (0.5 μg/NB1-140ifade ikna etmek için mL)-2xFV-Venüs 12 h için.</li>
	<li>NBB140ikna etmek-2xFV-Venüs harekete geçirmek ve 25 ile plazma zarı translocation homodimerizer 5 min için nM. Bu sefer canlı hücre görüntülemede gözlenen necroptosis kinetik üzerinden kurulur.</li>
	<li>Medyayı çıkarın ve 10 mL % 2.5 oxazolidin, 37 ° C'de önceden ısınmış % 2 paraformaldehyde 0.1 M sodyum cacodylate tampon pH 7.4 içinde (cacodylate arabellek) kullanarak hücreleri tamir</li>
	<li>Kazıma örnek toplamak ve örnekleri 500 x g, 10 min için spin. Süpernatant atmak.</li>
	<li>Örnek % 1.5 potasyum ferrocyanide 0.1 M sodyum cacodylate tampon ile 1,5 saat içinde indirimli % 2 osmiyum tetroxide için postfix. Osmiyum tetroxide TEM içinde kontrast sağlamak için yaygın olarak kullanılan boyama bir ajandır. TEM necroptosis geçiren hücre SEM önce ön analiz olarak kullanılır.</li>
	<li>Örnek 5 kere 5 min için ultrasaf su vasıl 500 x gdurular arabelleği ardından, durulama (bkz: 4.6), su ve etanol otomatik bir işlemci. Süpernatant atmak.</li>
	<li>SEM için % 1 uranyl asetat ve kurşun aspartat heavy metalci leke31ile daha önce sabit örnekleri leke.</li>
	<li>Alkol ve propilen oksit çözümleri kademeli bir dizi örnekleri kurutmak.</li>
	<li>Örnek bir reçine blok elde etmek için sert reçine32 içinde embed.</li>
	<li>Analiz doğru alan belirlemek için 0.5 mikron kalınlığında bölümlerini kes.</li>
	<li>Elektriksel olarak iletken metal (Iridium) ultra ince bir film örnekleriyle kat.</li>
	<li>Görüntü ve örneklerini (Şekil 3). Miktar için reçine blok yüzey maruz kalan hücrelerle düşük-büyütme resim 5'te taranır bir elektron mikroskop kullanarak keV.</li>
	<li>Hücrelerin SEM tarafından yakalanan bireysel görüntüleri karşısında görselleştirmek veya görüntüleme yazılımı birden çok alan görünümü bir bitişik resim30birleştirmek için kullanılan. Kabaca 100 hücreler hücreleri necroptosis bu şekilde seçim yazılımında yüksek çözünürlüklü resim dizisi oluşturarak geçiren kısmını değerlendirmek için kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek). Not: SEM tarafından nekrotik morfoloji Puanlama normal hücre özellikleri önceden nekrotik veya nekrotik fenotipleri ilerleme ile karşılaştırır. Bu özellikler microvilli ortadan kalkması da dahil olmak üzere, düzleştirme, yırtığı 10 arasında değişen hücrelerdeki plazma zarı değişiklikler içerir nm 1 µm boyutu veya organel yapısı sitozolik hücre alan en az % 30-40 arasında kaybı için.</li>
</ol>5. lipid bağlama, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi tarafından MLKL
<ol><li>15N etiketli NBB1-156 standart protein ifade ve arıtma yukarıda açıklanan24olarak hazırlayın.</li>
	<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol amonyum tuz (18:0 PI) ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) amonyum tuzu (18:1 PI) buz gibi CHCl3 her için son 1 mg/mL konsantrasyonda 500 µL 500 µg geçiyoruz.</li>
	<li>1 mg/mL 18:0 ve sonication su banyosu oda sıcaklığında 1 dk 18:1 PI solüsyon içeren temizleyicide veya en fazla 5 dakika içinde bir buz-su karışımı.</li>
	<li>
Aliquot 1 mg/mL 18:0 ve 18:1 PI içine temiz cam şişeler için bireysel NMR titrasyon serisi (Şekil 4). Transfer lipidler organik çözücüler hava geçirmez cam şırınga kullanarak içinde.
	<ol>
<li>1 mg/mL 18:1 PI aliquot 132 µL (molar kütlesi = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µM konsantrasyon, 1200 µL son resuspension hacmi için. Not: 5 mm NMR tüpler için seri seyreltme hacimleri hazırlamak > 1000 µL ve son NMR örnek hacimleri > 500 µL. 3 mm NMR tüpler için seri seyreltme hacimleri hazırlamak > 300 µL ve son NMR örnek hacimleri > 150 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 1 mg/mL domuz beyin 20 L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate amonyum tuzu: 9:1 CHCl3/MeOH/H2O (beyin PI (4,5) P2) temiz cam şişe içine.</li>
	<li>Şişeleri argon (Ar) veya azot (N2) karşı cam şişe duvarları sıçramasına olmadan organik çözücü buharlaşır için orta akış ile gaz akışı altına yerleştirin. Otuz beş dk 10-200 µL organik çözücü birimler için genellikle yeterli olur.</li>
	<li>Cam vial(s) Büchner veya vakum büyük Cımbız kullanarak flask altındaki bir kauçuk tıpa ile mühür ve bir vakum hattına bağlı plastik boru eklemek düzenlemek. Şişesi altında kalan organik kaldırmak için hafif vakum gecede tahliye edin.</li>
	<li>Lipid film aliquots inert gaz ile yerleşimi, hava geçirmez bir kapak ile mühür ve daha uzun vadeli depolama için kullanmak bir ay içinde veya-80 ° C-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>NMR örnek arabellek deterjan olmadan hazırlamak (-Det) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, %10 D2içeren O ve deterjan (+ Det ile) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, içeren %10 D2O, 0,34 mM n-Lauryl-β-D-maltopyranoside (demir).</li>
	<li>Ekle + cam şişe istenen toplama ulaşmak için ve su banyosu ilâ 30 dk sonication için 10 dk alternatif için solüsyon içeren temizleyicide lipid film ile Det arabelleğe görsel denetim tarafından takip. Not: Örnek Sonication sıcak. Oda sıcaklığında son protein örnek sulandırma önce 15 dakika soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Lipid-deterjan micelles + 1:1 karışımları sonication için istenen konsantrasyon serisi kullanarak Det arabellek seri seyreltme gerçekleştirin. 125 µM lipid konsantrasyonu başlayarak, üç tekrarlama 62.5 µM, 31.3 µM ve 15,6 µM lipid 0,34 mm DDM ortaya çıkarır.</li>
	<li>Denetim hazırlayın ve protein ve katkı - Det NMR örnekleri başvuru ve + Det arabellekleri, anılan sıraya göre. Protein ve lipit içinde her seyreltme için katkı + Det arabellek ekleyin. Not: 15N NBB156için protein 40 µM son bir konsantrasyon için eklendi ve azaltılmış Cys artıkları tutmak için 2 mM deuterated dithiothreitol ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Örnekler uygun hacmi (bkz: Not Adım 5,4) 5 mm veya 3 mm NMR tüpler aktarın.</li>
	<li>El ile yükleme örnekleri NMR alet veya bir Otomasyon platform SampleCase yükleyici gibi düzenleyin.</li>
	<li>Kalite kontrol en iyi duruma getirilmiş enine gevşeme spektroskopisi (TROSY) olarak 2D 1H -15N korelasyon spectra tarafından takip olarak 1H proton spectra için standart darbe programları kullanarak bileşik NMR spectra elde etmek veya heteronuclear birden fazla kuantum tutarlılık (SOFAST-HMQC)33. Not: 3 mm NMR tüpler kullanımı 1 H -15N TROSY (~ 3 h) veya 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 dk) 64 inceden inceye gözden geçirmek ister. Tarama numaraları 5 mm NMR tüpler için yarıya iner.</li>
	<li>İşlenmiş 2D NMR spectra çözümleme veya kullanıcıya diğer yazılım CARA depo34 eklenebilir.</li>
	<li>
Yazılım 2D NMR rezonanslar her protein durumu için üç iyi dağınık ve çözümlenen tepeler için ek açıklama ekleme tarafından analiz. Her NBB156 (Şekil 5A) içeren her arabellek koşul için altı zirvesinin en yüksek genlikleri kaydedin.
	<ol>
<li>Bir toplu iş-entegrasyon liste hazırlamak için Cara'yı kullanın (tıklatın ana menü başlığı "spektrum | Kurulum toplu iş listesi"...) Tüm spectra toplanan ve bir tek en yüksek atama dosyasını kullanarak analiz (tıklatın ana menü başlığı "tepeler | Peaklist alma"..... .ve 6 Toplam tepeler, 3 içinde tanımlanan her protein durum için bir .peaks Kullanıcı tanımlı dosya seçin).</li>
		<li>Uygulamasının ayarlarını ("ıntegrator | En yüksek Model tune"...) X-genişlikte 0.06 ppm ve Y-genişlik 0.30 ppm (tıklatın ana menü başlığı "ıntegrator | En yüksek Model tune"...) Son çıktı iki menü seçimlerini (1. kaydetmeden önce Ana menü başlığını tıklatın "ıntegrator | «««Entegre"toplu liste) (2. Ana menü başlığını tıklatın "tepeler | Entegrasyon tablosunu verin") (Şekil 5B). Not: Kalıntıları M21, V53 ve L105 omurga Amid rezonanslar NBB156 kapalı küme ayracı devlet için atanmıştır. Açık küme ayracı devlet omurga Amid rezonanslar kalıntılarının G130 ve A141 ve 3D NMR deneyler24kullanarak epsilon proton yan zinciri rezonans W133 atandı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri farklı mıknatıslar veya örnek koşullar doğrudan karşılaştırma için üç açık küme ayracı genlikleri başvuru örneklerinin ortalama ve iki başvuru ile ilgili bir normalleştirme faktörünün hesaplanması normalleştirmek. NBB156 rezonanslar normalleştirme faktörü ve ayar negatif genlikleri (Tablo 2) sıfır olarak kullanarak için ölçekli genlikleri hesaplayın. Örnekler: 1) farklı mıknatıslar örnekleri karşılaştırma: mıknatıs A, NBB156+ DDM ve mıknatıs B, NBB156+ DDM. 2) deterjan karşılaştırma: 0,34 mM DDM ve 1.7 mM DDM.</li>
	<li>Ölçekli kesir, kapalı - veya açık-tüm spectra ürününün için maksimum minimum genlik yelpazesi ile bölünerek küme ayracı içeren uygun başvuruları ücretsiz NBB156 ve tamamen açık ayraç NBB156 içinde toplanan her rezonans için hesaplamak deterjan.</li>
	<li>Normalleştirilmiş NMR genlikleri lipid konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak arsa ve açık küme ayracı NBB156 farklı koşullarda (şekil. 5 C) kısmını karşılaştırın. Not: Alternatif olarak, kapalı küme ayracı conformation lipid konsantrasyon karşı kısmını analizini NBB156lipid bağlama karşılaştırmak için gerçekleştirilebilir. Çünkü bu daha hızlı ve lipidler tarafından daha iyi kesir raporlarda tam-nişanlı eski analiz tercih ederim.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+development,+inflammation+and+disease.">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li><li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+mediates+the+embryonic+lethality+of+caspase-8-deficient+mice.">RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice.</a> Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).</li><li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pseudokinase+MLKL+mediates+necroptosis+via+a+molecular+switch+mechanism.">The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism.</a> Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+activity+of+the+caspase-8-FLIP(L)+complex+inhibits+RIPK3-dependent+necrosis.">Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis.</a> Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+complementation+between+FADD+and+RIP1+in+embryos+and+lymphocytes.">Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes.</a> Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li><li>Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+necroptotic+pathway.">An evolutionary perspective on the necroptotic pathway.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).</li><li>Newton, K., Manning, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+Inflammation.">Necroptosis and Inflammation.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).</li><li>Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+modulation+of+programmed+necrosis.">Viral modulation of programmed necrosis.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK3+deficiency+or+catalytically+inactive+RIPK1+provides+greater+benefit+than+MLKL+deficiency+in+mouse+models+of+inflammation+and+tissue+injury.">RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).</li><li>Kearney, C. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inflammatory+Perspective+on+Necroptosis.">An Inflammatory Perspective on Necroptosis.</a> Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+kind+of+cell+suicide:+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis.">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).</li><li>Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+execution+mechanisms+of+necroptosis:+an+overview.">Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3.">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li><li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis.">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death.">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li><li>Dillon, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3.">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li><li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis.">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li><li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF,+RIP3,+and+MLKL.">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li><li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAI+Another+Way:+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection.">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop.">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li><li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis.">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li><li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis.">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL.">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li><li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates.">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li><li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation.">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li><li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+secrets+of+fluorescent+proteins:+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation.">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks.">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated,+selectively+[1H,13C]-labeled+proteins.">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li><li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computer+aided+resonance+assignment+tutorial.">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+(RIP3)+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+(MLKL)+interaction+in+necroptotic+signaling.">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL.">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li></ol>

MLKL plazma zarı yırtılması24sözde cellat karıştığı için kombine teknikleri için iletişim kuralları sağlar. Necroptosis MLKL-aracılı düzenleyen yasal ağ deşifre ek olarak, bu tekniklerin uygun diğer biyolojik sistemleri tanımlamak için bağımsız olarak kullanılabilir. Pratik olarak konuşursak, bu teknikleri orta-düşük verimi keşif araçları vardır.
Biz düzenli olarak canlı hücre görüntüleme NBB140kullandık-2xFV-Venüs-a...

Necroptosis genetik bileşenleri tanımlayan necroptosis dolaylı fizyolojisi ve hastalığı1,2,3,4,5' te test etmek için hayvan modellerinin kullanımı kolaylaştırdı. RIPK3 veya MLKL nakavt farelerde en az dolaylı geliştirme ve yetişkin homeostazı o necroptosis için hayat3,6şart değil ima vardı. Ayrıca, bazı türler ya RIPK3 ya da MLKL genler, necroptosis olmayan temel rolü hayvanların7,8' destek içermez. Öte yandan, çeşitli patolojileri laboratuvarda indüklenen ile nakavt hayvan modelleri zorlu necroptosis inflamasyon, doğuştan gelen bağışıklık ve viral enfeksiyon9,10, önemli bir rol ortaya koymuştur 11 , 12.
Necroptosis etkinleştirilmesi birkaç şekilde farklı doğuştan gelen bağışıklık sensörler sinyal tarafından tüm belgili tanımlık harekete geçirmek RIPK31,13,14hangi sonucu. Active RIPK3 sırayla phosphorylates ve MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 etkinleştirir ,11,12,13,14,15,16,17,18. En iyi okudu ve belki de RIPK3 aktivasyonu için önde gelen en karmaşık yolu da apoptozis ya da necroptosis1ikna etmek için sinyal kompleksleri aşağı akım kompozisyona göre hangi bifurcates ölüm reseptör ligasyonu, geçiyor. RIPK1 sinyal tercih edilir ve nişan RIPK319,20sonuç Necroptosis ensues. Bu sonuç kolayca farmakolojik inhibisyon veya caspase 8, bir sözde endojen inhibitörü olan necroptosis koyunda tutar necroptosis genetik silinmesi üzerine tercih edilir. RIPK1 bağlar ve RIPK3'ı etkinleştirir. Necroptosis etkinleştirmek için başka bir yol TLR3/TLR4 Toll benzeri reseptörler sinyal aracılığıyla yürütmektedir ve RIPK3 tır etki alanını içeren bağdaştırıcı indükleyici interferon-β (TRIF)21aktive olduğu. Henüz doğrudan yürütmektedir ve RIPK322etkinleştirir DNA sensör DAI, etkinleştirme tarafından necroptosis tarafından ölmek için başka bir yol olduğunu.
MLKL bir N-terminal helix paket (NB) ve bir düzenleyici küme ayracı bölge3ile bağlantılı bir C-terminal pseudokinase etki alanı (psKD) oluşan sitozolik bir proteindir. Normal hücrelerde, MLKL nereye RIPK314ile etkin olmayan bir karmaşık olduğu düşünülen sitozol bulunur. Harekete geçirmek-in necroptosis MLKL RIPK3 fosforilasyon harekete geçirmek ilmik psKD ve NF ve kaşlı ayraç3,15,23yılında potansiyel olarak ek siteler içinde tetikler. Fosforilasyon ayrılma RIPK314sonuç MLKL konformasyon bir değişiklik neden olmaktadır. Kötü anlaşılır konformasyon değişiklikleri küme ayracı psKD24yayın. 2 sarmal içeren küme ayracı, MLKL Oligomerizasyonda sözde trimer ile C-terminal helix25içine aracılık eder. Brace N-terminal helix membran permeabilization24,26için gerekli olan NB etki alanı engeller. Tecrit NB etki alanı plazma zarı permeabilization ve necroptosis16,24,27ikna etmek yeterlidir. NB pro-necroptotic etkinliği içinde fare embriyonik fibroblastlar MLKL (mlkl- / - MEFs) eksik öldürüldüğüne tanıklık etmişlerdir. NB tercihen fosfolipid phosphatidylinositol 4,5 nükleotittir (PIP2) yürütmektedir bir lipid bağlayıcı etki alanıdır. Biz MLKL, onda MLKL alımı için plazma zarı NB zayıf etkileşimler PIP2 kutup baş grup24ile üzerinden küme ayracı Oligomerizasyonda kolaylaştırır aktivasyon kademeli bir mekanizma önerdi. Membran NB PIP2etkin olmayan MLKL brace tarafından maskeli için bir ek yüksek afinite bağlama sitesinin düzenlenmiş pozlama uğrar. Genel olarak, her ne kadar bu olayların moleküler mekanizması-değil var aydınlatılmamıştır NB birden çok etkileşimler PIP2 ile onun kopmalara önde gelen plazma zarı istikrarsızlaştırmak.
Burada MLKL işlevini necroptosis24cellat tanımlamak için kullanılan belirli yöntemleri gösterilmektedir. Özellikle, biz odaklanmak en az etki alanı MLKL, NB ve küme ayracı (NBB), hangi küme ayracı inhibisyon tarafından düzenlenir ve plazma membran rüptürü ve necroptosis ikna etmek için zorunlu dimerization ile aktif hale getirebilirsiniz. Biz zorunlu uyuşturucu kaynaklı FKBP-aracılı dimerization canlı hücre görüntüleme ve necroptosis geçiren hücrelerin elektron mikroskobu ile birlikte bizim indüklenebilir ifade sistemi açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim vitro NMR Analizi NBB etkileşimleri ile phosphatidylinositols (pip) göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cloning and cell line generation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivator plasmid</td><td></td><td></td><td>Llambi &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2016</td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell death quantification and live-cell microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Homodimerizer AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NMR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Ammonium Chloride</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Deuterated DTT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialized Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR or ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Live-cell microscopy imaging</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Electron microscope</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Imaging analysis</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td><td>EM analysis</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>NMR data collection</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&amp;nbsp;</td><td>NMR data analysis</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Confocal microscopy</td></tr></tbody></table>

characterization of mlkl-mediated plasma membrane rupture in necroptosis

Necroptosis phosphorylates ve karışık soy kinaz benzeri etki alanı pseudokinase, MLKL rüptürü veya plazma zarı permeabilize, aktive protein kinaz 3 (RIPK3), etkileşim reseptör etkinleştirme tarafından tetiklenen bir programlı hücre ölümü yoludur . Necroptosis otoimmünite, bulaşıcı ve kalp-damar hastalıkları, felç, ateş ve kanser de dahil olmak üzere birden çok patolojileri ile ilişkili inflamatuvar bir yoludur. Burada, MLKL necroptosis plazma zarı kopma cellat olarak karakterize etmek için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Biz necroptosis confocal ve konvansiyonel floresans mikroskobu ile canlı hücre Imaging'i kullanma hücreleri ve sabit hücrelerin elektron mikroskobu, birlikte plazma için sitozol üzerinden MLKL dağıtılması ortaya kullanarak işlem görselleştirmek membran plazma zarı büyük delikler indüksiyon öncesinde. Biz MLKL-aracılı necroptosis sözde modülatörler tanımlamak için lipidler kullanarak vitro nükleer manyetik rezonans (NMR) analiz mevcut. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, biz nicel lipid-bağlama tercihleri ve phosphatidyl inositol fosfatlar (pip) MLKL, plazma zarı hedefleme ve necroptosis permeabilization için gerekli olan kritik bağlayıcı olarak tespit edilmiştir.

Düzenlenmiş necroptosis yürütme canlı hücrelerdeki görselleştirme en az bir kesilmiş yapı, NBB140MLKL indüklenebilir ifade yoluyla mümkün olmuştur-2xFV-Venüs. Bu yapıyı plazma zarı permeabilization ikna yeteneği korur ve Dim kaynaklı Oligomerizasyonda FKBP kaset (2xFV) etkinleştirilir. Biz gözlemlemek ve necroptosis tarafından Imaging, kinetically (her 5 dk) bir hücre geçirimsiz yeşil floresans DNA bağlama boya (Şekil 6<...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis at JoVE.com

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Görüntüleme.  St. Jude Children's Research Hospital. Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.

Video: Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of nuclear apoptotic characteristics, including chromatin condensation and DNA breakage. Once the MMP collapses, cell apoptosis will initiate irreversibly. A series of lipophilic cationic dyes can pass through the cell membrane and aggregate inside the matrix of mitochondrion, and serve as fluorescence marker to evaluate MMP change. As one of the six members of the Cl- intracellular channel (CLIC) family, CLIC4 participates in the cell apoptotic process mainly through the mitochondrial pathway. Here we describe a detailed protocol to measure MMP via monitoring the fluorescence fluctuation of Rhodamine 123 (Rh123), through which we study apoptosis induced by CLIC4 knockdown. We discuss the advantages and limitations of the application of confocal laser scanning and normal fluorescence microscope in detail, and also compare it with other methods.

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Here we present a detailed protocol for the application of rhodamine 123 to identify the mitochondrial membrane potential (MMP) and study CLIC4 knockdown-induced HN4 cell apoptosis in vitro. Under common fluorescence microscope and confocal laser scanning fluorescence microscope, the real-time change of the MMP was recorded.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Kanser Araştırmaları

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Nörobilim

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical regulators of necroptosis, an inflammatory form of cell death with important antiviral functions. Autophosphorylation of RIPK3 induces phosphorylation and activation of the pore-forming executioner protein of necroptosis MLKL. Trafficking and oligomerization of phosphorylated MLKL at the cell membrane results in cell lysis, characteristic of necroptotic cell death. The nucleic acid sensor ZBP1 is activated by binding to left-handed Z-form double-stranded RNA (Z-RNA) after infection with RNA and DNA viruses. ZBP1 activation restricts virus infection by inducing regulated cell death, including necroptosis, of infected host cells. Immunofluorescence microscopy permits the visualization of different signaling steps downstream of ZBP1-mediated necroptosis on a per-cell basis. However, the sensitivity of standard fluorescence microscopy, using current commercially available phospho-specific antibodies against human RIPK3 and MLKL, precludes reproducible imaging of these markers. Here, we describe an optimized staining procedure for serine (S) phosphorylated RIPK3 (S227) and MLKL (S358) in human HT-29 cells infected with herpes simplex virus 1 (HSV-1). The inclusion of a tyramide signal amplification (TSA) step in the immunofluorescent staining protocol allows the specific detection of S227 phosphorylated RIPK3. Moreover, TSA greatly increases the sensitivity of the detection of S358 phosphorylated MLKL. Together, this method enables the visualization of these two critical signaling events during the induction of ZBP1-induced necroptosis.

Tyramide signal amplification during immunofluorescent staining enables the sensitive detection of phosphorylated RIPK3 and MLKL during ZBP1-induced necroptosis after HSV-1 infection.

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Biyoloji

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous research indicated that multiple pathways could mediate the spontaneous death of neutrophils. A cocktail was developed by simultaneously targeting these pathways, caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor (CLON-G), which prolonged the neutrophil lifespan to greater than 5 days without significantly compromising the neutrophil function. Concurrently, a reliable and stable protocol for assessing and evaluating neutrophil death was also developed. In this work, we show that CLON-G can prolong the neutrophil lifespan in vitro to more than 5 days, and we exhibit the lengthening of the neutrophil lifespan with FACS and confocal fluorescence microscopy. This report introduces procedures for the preparation of CLON-G and showcases an in vitro spontaneous death assay of neutrophils, which can be used for the study of neutrophils and for subsequently interrogating neutrophil death, thus providing a reliable resource for the neutrophil community.

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

This protocol details the preparation of CLON-G to extend the neutrophil lifespan to greater than 5 days and provides a reliable procedure for evaluating neutrophil death with flow cytometry and confocal fluorescence microscopy.

CLON-G ile Nötrofil Yaşam Süresinin Uzatılması ve In Vitro Spontan Ölüm Testi

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

THP-1 Hücrelerinde LPS/ATP ile Tetiklenen Hücre Ölüm Mekanizmalarının Analizi

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. LPS combined with ATP is a classic inflammatory induction method, often used to study pyroptosis, but apoptosis and necroptosis also respond to stimulation by LPS/ATP. Under normal circumstances, phosphatidylserine is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, the cell membrane remains intact and exposed to phosphatidylserine, and in the later stages, the cell membrane loses its integrity. Here, flow cytometry was used to analyze Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (AAD) double staining to detect the cell death from the whole cells. The results show&#160;that substantial cells died after stimulation with LPS/ATP. Using scanning electron microscopy, we observe the possible forms of cell death in individual cells. The results indicate that cells may undergo pyroptosis, apoptosis, or necroptosis after stimulation with LPS/ATP. This protocol focuses on observing the death of macrophages after stimulation with LPS/ATP. The results showed that cell death after LPS and ATP stimulation is not limited to pyroptosis and that apoptosis and necrotic apoptosis can also occur, helping researchers better understand cell death after LPS and ATP stimulation and choose a better experimental method.

Yazar Spotlight: LPS / ATP'ye THP-1 Makrofaj Yanıtı - Pipoptoz, Apoptoz ve Nekrotoz Spektrumunun Ortaya Çıkarılması

This protocol is based on LPS and ATP-induced death of PMA-differentiated THP-1 macrophages. We use flow cytometry to analyze Annexin V and 7-AAD double staining to detect cell death, using the whole cell and employing scanning electron microscopy to observe the cell membrane morphology.

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

CLON-G ile Nötrofil Yaşam Süresinin Uzatılması ve In Vitro Spontan Ölüm Testi

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu