Bu protokol, hücre ölüm süreçlerinin aktivasyonunun çok yönlü bir şekilde anlaşılmasını sağlar, bu da hastalık mekanizmaları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir ve terapötik stratejileri bilgilendirebilir. Bu protokol, daha basit bir tekniğin kullanılmasına ve aktivasyonu büyük ölçüde belirlemek için endojen hücrelerin tek bir popülasyonundan zorunlu olan çoklu kaspazların aktivasyonuna erişmeye dayanır. Doğuştan gelen bağışıklık hücresi ölümü, enfeksiyonlardan enflamatuar hastalıklara ve kanserlere kadar hastalık spektrumunda rol oynamıştır.
Kaspaz aktivasyonu yoluyla hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını anlamak, hastalık süreçlerine kritik bilgiler sağlayabilir. Bir laboratuvardan doktora sonrası araştırma görevlisi olan Dr. Julieann, prosedürü gösterecek. Kemik iliğini izole ettikten ve BMDM'leri ayırt ettikten sonra, hücreleri influenza A virüsü ile enfekte edin.
20 plak oluşturan birimin enfeksiyon çokluğunda ihtiyaç duyulan virüs hacmini hesaplayın. Ortamı BMDM'lerden çıkarın ve hücreleri bir kez 500 mikrolitre PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa ısı inaktive FBS olmadan yüksek glikozlu DMEM'e 450 mikrolitre İnfluenza A virüsü ekleyin ve emilime izin vermek için plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bir saatlik inkübasyonun sonunda, 50 mikrolitre ısı inaktive edilmiş FBS ekleyin ve plakaları toplam 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre geri koyun. 12 saatlik inkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın. 150 mikrolitre süpernatantı aspire edin ve süpernatant analizi için atın veya saklayın.
Kalan süpernatanı çıkarmayın. Şimdi, kuyucuk başına 50 mikrolitre kaspaz lizis tamponu ve 100 mikrolitre dört XSDS tamponunu birleştirerek protein toplama çözeltisini oluşturun. Ardından, her bir oyuğa 150 mikrolitre karışım ekleyin.
Her kuyucuk için, lize hücreleri ve süpernatan toplamak için karışımı pipetleyin. Pipetleme yaparken, hücreleri bozmak için pipet ucuyla kuyunun tabanını kazıyın. Kazıma ve pipetlemeden sonra, protein lizatını etiketli 1,5 mililitrelik tüplere toplayın.
Bir ısı bloğu kullanarak, tüm tüpleri 12 dakika boyunca 100 santigrat dereceye ısıtın. Tüpleri ısı bloğundan çıkarın ve çözünmeyen bileşenleri peletlemek için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 14.500 G'de santrifüj yapın. Elektroforez aparatını 10 kuyucuklu% 12'lik bir poliakrilamid jel ile hazırlayın.
Elektroforez aparatını çalışan tamponla doldurun ve jel tarağını çıkarın. Ardından, numuneleri beş dakika boyunca 100 santigrat derecede ısıtın. Yüklemeden önce numuneleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 14.500 G'de santrifüj yapın.
Ardından, numunenin 30 mikrolitresini yavaşça her bir kuyucuğa yükleyin. Kombine süpernatant ve protein lizat ve kaspaz lizis tamponu veya kaspaz 1, 3, 7 ve 8 lekeleri için doku homojenatı kullanın ve protokolde açıklanan protein lizat DN RIPA tamponunu veya kaspaz 11 ve 9 için doku homojenatını kullanın. Altı kaspazın tümünü aynı anda değerlendirmek için, aynı numuneleri altı jelin her birine yüklemek için aynı prosedürü kullanın.
Elektroforez aparatını güç kaynağına bağlayın ve jel çalışmasına başlamak için gücü 20 dakika boyunca 80 volta ayarlayın. İlk 20 dakikadan sonra, gücü 45 ila 60 dakika boyunca 100 volta ayarlayın. Boya önünü gözlemleyin.
Boya cephesi jelin dibine ulaştığında, gücü kapatın. Jel çalışırken, transfer tamponunu makalede açıklandığı gibi hazırlayın. Çözümü her seferinde taze yapın.
Jeli elektroforez aparatından jel salınımını kullanarak çıkarın. Jel için transfer yığınını ayarlamak için, bir PVDF membranını bir dakika boyunca metanole batırarak aktive edin. İki parça filtre kağıdını, jeli ve PVDF membranını önceden ıslatın ve tamponu beş dakika boyunca aktarın.
PVDF membranını ve jeli bu beş dakikalık inkübasyon sırasında ayrı kaplarda saklayın. Transfer yığınını yarı kuru sisteme monte etmeye başlayın. Alt platin nano tarafına, bir parça filtre kağıdı, PVDF membranı, jel ve son olarak bir parça filtre kağıdı yerleştirin.
Hava kabarcıklarını katmanlar arasında yavaşça yuvarlayın veya bastırın ve sistemin üst kısmını kapatın. Şimdi, güç kaynağına bağlanın. Gücü 40 dakika boyunca 25 volta ayarlayın.
Transferden sonra, transfer yığınını sökün, zarı toplayın ve kare bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, 15 mililitre% 5'lik yağsız bir süt çözeltisi ekleyerek membran blokajı yapın ve membranı bir saat boyunca oda sıcaklığında 50 ila 70 RPM'de sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın, seyreltilmiş antikor çözeltisinden 10 mililitre ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi, oda sıcaklığında iki saat veya sallanan bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca dört santigrat derece inkübe edin.
Daha sonra, antikor çözeltisini toplayın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcıda membrana 15 mililitre TBST ekleyerek zarı yıkayın. TBST'yi atın. Yıkamayı 15 mililitre TBST ile üç kez tekrarlayın.
Seyreltilmiş ikincil HRP konjuge antikor çözeltisinden 10 mililitre ekleyin. Bir saat boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcıda inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, antikor çözeltisi çıkarıldıktan sonra, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcıya 15 mililitre TBST ekleyerek zarı yıkayın.
Yıkama adımlarını tamamladıktan ve TBST'yi çıkardıktan sonra, 10 mililitre yüksek hassasiyetli HRP substratı ekleyin. Bir dakika oda sıcaklığında bekletin. Membranı substrattan çıkarın.
Aksesuar beyaz trans tepsisi alt konuma yerleştirilmiş bir kemilüminesans görüntüleyici kullanarak doğrudan görüntülemeye devam edin. Otomatik pozlama modunu kullanarak membranı pozlayın. İnfluenza A virüs enfeksiyonu sonrası vahşi tipte pro ve aktive kaspaz 1, 11, 3, 7, 8 ve 9, HSV1 enfeksiyonu sonrası vahşi tip ve AIM2 mutantı ve lipopolisakkarit ve ATP stimülasyonu sonrası Francisella novicida enfeksiyonu veya vahşi tip ve NLRP3 mutant BDM'leri analiz edilir.
Yukarı akış PANoptoz sensörlerinden yoksun hücreler, konyak PANoptozu indükleyen uyaranlara yanıt olarak sağlam hücre ölümüne uğramaz. İnfluenza A virüsü enfeksiyonu ZBP1-PANoptozom oluşumunu indükler ve ZBP1 eksikliği olan hücreler, İnfluenza A virüsü enfeksiyonu sırasında hücre ölümünden önemli ölçüde korunur. Benzer şekilde, HSV1 ve Francisella novicida enfeksiyonları AIM2 PANoptozomunun oluşumunu indükler ve AIM2 eksik hücreleri bu enfeksiyonlara yanıt olarak sağlam hücre ölümüne maruz kalmazlar.
Yukarı akış enflamatuar sensörleri olmayan hücreler, ilgili uyaranlarına yanıt olarak hücre ölümünden korunur ve NLRP3 eksikliği olan hücreler, lipopolisakkarit ve ATP'ye yanıt olarak hücre ölümüne uğramaz. Belirli bir kaspazı belirlemek için her iki hücre lizatının bir karışımını hazırlamayı hatırlamak önemlidir. Jeti yükledikten sonra, parlak numune, takip için kaspaz hedeflerinin bütünlüğünü korumak için eksi 20 derece saklanmalıdır Bu protokolle birlikte, hücre ölümünün yürütülmesini izlemek için gerçek zamanlı hücre ölümü görüntüleme veya LDH tahlilleri kullanılabilir ve ELIZA'lar, farklı hücre ölümü türlerine maruz kalan hücrelerden sitokinlerin veya DAMP'lerin salınımını kontrol etmek için kullanılabilir.
