Nekrotoz indüksiyonu sırasında iki önemli sinyal olayı olan fosforile RIPK3 ve MLKL'nin sağlam bir şekilde görselleştirilmesi teknik olarak zor olmuştur. Sunulan tiramid amplifikasyon protokolü, bu iki molekülün hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Sinyal amplifikasyon adımı, fosforile RIPK3 ve MLKL'nin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde algılanmasını sağlayarak algılama eşiğini düşürür.
90.000 ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini tam güçte McCoy's 5A ortamında bir santimetre karelik bir yüzey alanı kuyu plakasında tohumlamaya başlayın ve üst düzey mikroskopiye izin verin. Kuyu başına 200 mikrolitrelik bir uç hacim kullanın. Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri önceden ısıtılmış 200 mikrolitre, tam mukavemetli McCoy'un herpes simpleks virüsü içeren 5A ortamını enfekte eder ve bir jant mutant ICP6'yı beş enfeksiyon çokluğunda kodlar. Nekropsi indüklemek için hücreleri dokuz saat boyunca virüsle inkübe edin. Nekrotoz indüksiyonu için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 200 mikrolitre önceden ısıtılmış nekroptozise neden olan kokteyl ile dört saat boyunca uyarın.
Negatif bir kontrol olarak, RIPK3 kinaz aktivitesini inhibe etmek için 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış 22 mikrolitre 10 mikromolar GSK840 ekleyin. Bu inhibitörü, tedavi edilmemiş bir durumda ve serin 227'nin otofosforilasyonunu önlemek için nekroptoz stimülasyonundan sonra dahil edin. Hücreleri sabitlemek için ortamı çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında dengelenmiş 150 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyondan sonra,% 4'lük paraformaldehiti çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın.
Numuneler, bir sonraki işleme kadar gece boyunca dört santigrat derecede PBS'den fazla saklanabilir. PBS'yi plakadan çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre geçirgenlik tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, geçirgenlik tamponunu çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın.
Görüntüleme odasını, yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkama tamponu ile inkübe edin. Birincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, plakayı yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında iki saat boyunca oda sıcaklığında 100 mikrolitre bloke edici ortam ile inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez, yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonla yıkayın.
Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, görüntüleme odasına 100 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Tiramit sinyal amplifikasyonunun potansiyel arka planını görselleştirmek ve maskeleme eşiğini ayarlamak için birincil antikor içermeyen bir durum içerdiğinden emin olun. Odayı bir gecede dört santigrat derecede inkübe edin.
Birincil antikor karışımını çıkarın ve kuyucukları, eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonla 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre HRP etiketli sekonder antikor ile inkübe edin ve eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında 30 dakika boyunca çoğaltılacak birincil antikor türlerini tanıyın. Antikor inkübasyonu sırasında, biyotinile tiramid karışımını hazırlayın.
HRP'nin enzimatik aktivitesini tetiklemek için, kullanmadan önce TSA tamponuna taze olarak oksitleyici bir substrat ekleyin. Daha sonra, optimize edilmiş seyreltmeyi kullanarak hazırlanan TSA tamponundaki biyotinillenmiş tiramid seyreltin. HRP etiketli sekonder antikor ile inkübasyondan sonra, kuyucukları üç kez, eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında beş dakikalık inkübasyonla yıkama tamponu ile yıkayın.
Yıkama tamponunu kuyudan çıkardıktan sonra, seyreltilmiş biotin-tiramid kuyuya 100 mikrolitrelik bir uç hacme ekleyin. Oda sıcaklığındaki reaksiyonu eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında 10 dakika boyunca inkübe edin, ardından üç yıkama tamponu yıkayın. İkincil antikor, birleştirilmiş streptavidin ve nükleer leke ve yıkama tamponunu içeren boyama karışımını hazırlayın.
Yıkama tamponunu çıkarın ve plakayı 100 mikrolitre boyama karışımı ile oda sıcaklığında bir saat boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Bu adımdan itibaren görüntüleme odalarını ışıktan koruyun. Boyama işleminden sonra, art arda iki kez yıkama tamponu ile yıkayın ve kuyucukları PBS ile iki kez durulayın.
Görüntülemeye kadar lekelenmeyi korumak için PBS'yi aşan örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme odası artık konfokal mikroskopta görselleştirilmeye hazırdır. Tiramit sinyal amplifikasyonunun dahil edilmesi, herpes simpleks virüsünün sitosolünde serin 227'de fosforile edilmiş RIPK3'ün sağlam bir şekilde tespit edilmesini sağladı ve bir jant mutant ICP6 ile enfekte olmuş hücreleri kodladı.
Hassas algılama için %2'lik bir lazer gücü yeterliydi. Standart dolaylı immünofloresansta, fosfo-RIPK3'ün tespiti için daha yüksek bir lazer gücü yetersiz kalmıştır. Üç boyutlu Z-yığını görüntülerinin nicelleştirilmesinde, enfekte olmuş hücreler, sahte tedavi edilen hücrelere göre fosforile edilmiş RIPK3 için pozitif voksellerin yaklaşık 20 kat arttığını gösterdi.
Vahşi tip herpes simpleks virüsü bir enfekte hücrenin sahte tedavi edilen hücrelere kıyasla artan fosfo-RIPK3 boyaması, ICP6'nın jant alanının serin 227'de RIPK3 fosforilasyonunu tamamen bloke edemediğini göstermiştir. GSK840, RIPK3'ün kinaz alanına bağlanır ve ZBP1 aktivasyonu üzerine serin 227'de RIPK3 fosforilasyonunu önler ve tiramid sinyal amplifikasyonu aracılı fosfo-RIPK3 algılama yönteminin özgüllüğünü doğrular. Alaycı muamele görmüş hücreler, serin 358'de MLKL fosforilasyonunun hafif noktalanmış sitozolik boyanmasında düşük gösterirken, enfekte olmuş hücrelerin sitozol, çekirdek ve plazma zarında güçlü boyama tespit edildi.
Standart dolaylı immünofloresan, enfekte hücrelerde fosfo-MLKL sinyalinin spesifik tespiti için% 40 lazer gücü gerektiriyordu. Buna karşılık, tiramid sinyal amplifikasyonu, fosfo-MLKL'nin algılama hassasiyetini arttırdı, böylece gerekli lazer gücünü% 6'ya düşürdü3D Z-yığını görüntü niceliği, standart yöntemi kullanarak yedi kat artışa kıyasla, tiramid sinyal amplifikasyonu kullanarak fosfo-MLKL için pozitif voksel sayısında yaklaşık 90 kat artış gösterdi ve fosfo-MLKL için gelişmiş algılama eşiği ve duyarlılığı gösterdi. Herpes simpleks virüsü birine benzer şekilde, influenza A virüsü enfeksiyonu ZBP1'e bağımlı nekroptozu tetikledi.
Tiramit sinyal amplifikasyonu, nekropsitozu gösteren fosfo-RIPK3 ve fosfo-MLKL'nin sağlam bir şekilde algılanmasına izin verdi. Konfokal boyamayı yorumlamak için, birkaç boyama kontrolünün dahil edilmesi gerekir. Bu, birincil koşul olmadan, tek lekeler ve pozitif bir kontrol gerektirir.
Bu protokolü uyarlayarak, sıralı TSA kullanılarak birden fazla hedef güçlendirilebilir. Bu, aynı hücre içinde fosforile RIPK3 ve MLKL'nin tespit edilmesini sağlayacaktır. Nekrotoz biyobelirteçlerinin hassas tespiti, yürütülen ZBP1'e bağımlı hücre ölüm yollarının hala nekroptoz, apoptoz veya pirotoksoz olarak doğrulanması gereken otoinflamasyon veya virüs enfeksiyonu üzerine devam eden ZBP1 araştırmaları için anlayışlı olabilir.
