Bu çalışmada sağlık araştırma (CIHR) işletim Grant paspas-123419, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada keşif Grant 418194 ve bir Ontario Bakanlığı araştırma ve yenilik erken Araştırma Ödülü BH için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. DGW bazı resimler, iletişim kuralları'nın bir optimizasyon ve el yazması yazma sunulan katkıda bulunmuştur; Liverpool Üniversitesi bir pompa astar hibe tarafından finanse edildi. CY Vanier Yüksek Lisans Burs ve CIHR MD/doktora öğrencilik tarafından finanse edilmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Bu protokol için özetlenen yöntemleri görüntüleme ve miktar sabit-hücre ve canlı hücre yaklaşımları kullanarak dinamik efferocytic işleminin etkinleştirin. Bu yaklaşımlar yaygın istihdam akış sitometresi tabanlı yöntemleri23,24çeşitli avantajlar sunuyor. Inside-out ile sabit örnekleri boyama kullanım oranı daha sağlam ve doğru miktar ve efferocytosis kapsamı sağlar — gerçekten de, birçok akış sitometresi tabanlı yöntem sadece apoptotik hücreler ve makrofajlar ile farklı fluorophores, etiket ve Skor efferocytosis böylece birbirinden ayırmak için kapasite yoksun apoptotik hücre marker ile birlikte boyama makrofajlar kesir olarak içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi karşı bağlı. Alternatif akış sitometresi yaklaşım bu apoptotik hücreler24etiketli pHrodo kullanarak içerir. pHrodo asidik ph parlaklığı artar pH duyarlı fluorophore var. Bu fluorophore arasında daha iyi çözünürlük sigara içselleştirilmiş-içselleştirilmiş malzemeleri karşı özellikle aşağıdaki apoptotik hücre içselleştirilmesi ve efferosome asitleştirme floresans arttıkça sunarken sonuçları olabilir Hangi efferosome asitleştirme34,35zarar hastalık işlemler tarafından şaşırmış ve bu yöntem-ecek vuramamak efferosomes efferocytosis36asitleştirme-yoksul bölgelerinde yer alan, erken (öncesi asitleştirme) evresinde hücre27, veya zayıf onların organellerin37acidify hücreleri. Bu protokol için açıklanan yöntemin ikinci bir avantajı canlı hücre efferocytosis, dinamiği, yoklama efferocytic sinaps oluşumu gibi işlemler olarak ölçmek için Imaging kullanılır ve hücre içi efferosomes kaçakçılığı olamaz Akış Sitometresi tabanlı yaklaşımlar kullanarak algıladı.
Bu yöntem birçok avantajları sunarken, hücreleri yüzlerce miktar gerektiren deneyler — Örneğin nadir olayları algılama veya son derece değişken işlemleri miktarının deneyler — bu büyük veri analizi ile zor olabilir gereğinden fazla zaman alıyor. Her ne kadar bizim deneyim geçerli otomatik görüntü analiz programları her zaman doğru bir şekilde segmentlere ayırma yeteneği olmayan yüksek-den geçerek akış görüntüleme gibi yaklaşımlar Imaging sitometresi38 geleneksel mikroskobu, daha yüksek üretilen iş için izin verebilir Sigara-içselleştirilmiş karşı içselleştirilmiş malzemeler. Özellikle, hangi formları apoptotik hücre ve efferocyte arasında sıkı efferocytic sinaps streptavidin boyama dışlayabilirsiniz ve bu nedenle ilişkili apoptotik hücre kez tarafından kısmen saran bir solid kitle boya kanal, izleme hücre olarak görünür streptavidin boyama (Şekil 2). Efferosomes kolayca algoritmalarla belirlenir iken, böylece, apoptotik hücre bağımlı bölümünü kez kısmi streptavidin boyama için muhasebe zorluk nedeniyle bir efferosome olarak tanımlanmış. Biz doğru tanımlamak ve ölçmek apoptotik hücreler insan yardımı olmadan parçalı alımını bir programı bulmak için henüz, biz bu öğretilebilir yarı otomatik sistemler39 analizi, büyük ölçüde hızlandırabilir kesir azaltarak bulduk efferocytosed ölçümler için 2-3 dk dan < 60 s hücre başına. Alternatif olarak, sindirilebilir apoptotik hücre taklit eder veya en az parçası apoptosis, hücre tipleri yerine kullanılabilir. Bu algılama otomatik yaklaşımlar daha müsait olabilir ve z-istifleme gereksinimini ortadan kaldırabilir tek ve büyük yapılar için kolaylaştırır. Hatta bu gelişmeler ile bu yöntem toplama ve Analizi hız sınırlayıcı kalır ve analizleri büyük hücreli sayı gerekli23gibi akış sitometresi en uygun yöntem kalır.
Her ne kadar hücre satır ve birincil insan makrofajlar hedefi olarak efferocytes ve apoptotik Jurkat hücreler (T hücre satırı) olarak kullanma bu yöntem tarif var, bu yöntem herhangi bir efferocytic hücre türü veya apoptotik hücre hedef için uygulanabilir. Gerçekten de, benzer yaklaşımlar tetkikine ve epitel hücreleri9,40,41efferocytosis ve tümör hücreleri42gibi klinik hedeflerinden efferocytosis araştırmak için kullanılmaktadır. Non-immün efferocytes kullanırken veya belirli efferocytic olaylar modelleme bu iletişim kuralını değiştirmek gerekli olabilir. Örneğin, Jurkat hücreleri yapışık olmayan ve bu nedenle tamamen mekanik Kuvvetleri özetlemek ve kayma sınırlamaları efferocytes yapisan apoptotik hücreler veya sağlam dokularda apoptotik hücreler ile iletişim halinde olduğu zaman karşılaşmak olası için değildir. Birçok hücre tipleri yapışma apoptosis sırasında korur ve bu nedenle yapisan hedef olarak kullanılabilir; bir örnek olarak, HeLa hücreleri tekrarlanarak staurosporine kaynaklı apoptosis, Fosfatidilserin çabalıyorlar ve blebbing yapışma hücre vücut43korurken 4-6 h süre geçmesi. Biz bu yaklaşımlar kullanan herhangi bir çalışmaları farkında olmasına rağmen hücreleri kollajen matris veya kök hücre kaynaklı organoids44 askıya efferocytosis sağlam dokularda çalışmak için potansiyel modelleri olabilir. Bazı modeller gibi Jurkat hücreleri bağışıklık hücreleri ve nötrofil değil kullanılmalıdır apoptotik hedef olarak bu hücreler sitokin tabanlı serbest olabilir gibi "bulmak-beni" sinyalleri modelleri karıştırıcı bir faktör enflamatuar veya göçmen nerede olabilir CX3CL1 gibi incelenen45işlemlerdir. Bu tahlil çok yönlülük için o efferocytosis hücre tipleri ve model sistemleri aralığında keşfetmek için kullanılmak üzere izin verirken, böylece, uygun efferocytes, hedef hücreleri ve kültür koşulları için en iyi modeli fizyolojik seçmeye özen göstermelidir soruşturma altında işlem.
Bu protokol için açıklanan analiz yöntemleri yalnızca bu deneyler analizleri geniş bir etkinleştirme görüntüleme tabanlı doğası ile bir başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Örneğin, efferosome konumlandırma ve çapı ölçümleri kesir efferocytosed ölçümleri yapılırken toplanan veya canlı hücre içinde ölçülen, hücre içi kaçakçılığı gibi işlemler araştırmak için zaman-kursları, hücre yıkımı13,15efferosomes ve apoptotik oranı. Immunostaining (Şekil 4) morfolojik analizleri ile birlikte yaşamak-hücre görüntüleme süreçleri ölçmek için kullanılan iken böyle bağlama etkinliği ve oranları engulfment30 efferosomes, protein alımı araştırmak için kullanılabilir , 46. sık sık bu deneyleri molekül etkinleştirme veya etkinliğini hücresel olaylar efferocytosis (Şekil 6) sırasında sinyal rapor floresan transgenes ifade makrofajlar içinde gerçekleştiriyoruz. Bu gazetecilere efferocytosis sırasında süreçleri sinyal izlemeyi etkinleştir; Örneğin, efferosome işleme ve sonraki apoptotik hücre kaynaklı antijenleri13,15kaçakçılığı arabuluculuk rolü Rab5, Rab7 ve Rab17 keşfetmek için Rab GTPases fluorescently öğesini kullanmış. Benzer şekilde, gazetecilere hücre ölümü, efferosome pH, reaktif oksijen türleri üretim ve diğer hücresel süreçler canlı hücre deneyleri içine birleşme efferosomes31 bozulması arabuluculuk işlemlerini araştırmak için kullanılabilir ,47. Bu deneyler ortak mücadelesine transgenes veya gazetecilere ile uyumlu fluorophores tanımlıyor; çoğu zaman, boya ve/veya ücretsiz kanalları için diğer fluorophores düşsel streptavidin izleme hücre ortadan kaldırır. Bazı deneyler için apoptotik hücre sigara parçalanan taklit ile değiştirmek faydalıdır. Bu dinamikleri ve birden çok efferosomes bir tek apoptotik hücre elde izleme karmaşıklığı olmadan hücresel süreçler sinyal miktar sağlar. Evans ve ark. bkz: apoptotik hazırlama yönergeleri için28hücre taklit eder.
Bu deneyler tasarlarken en yaygın zorluk, photobleaching ve fototoksisite29en aza indirerek yansıması istenen işlemler için izin fluorophores bir arada bulgudur. Fluorophore seçimi büyük ölçüde lazerler/uyarma filtreleri, dichroics/küpler tarafından dikte edilir ve mikroskop emisyon filtreler ve bu nedenle fluorophores seçim için bireysel mikroskoplar belirli kez. Genel olarak, daha uzun dalga boyu fluorophores (far-red, Örneğin emisyon maxima turuncu > 580 nm) photobleaching için daha az eğilimli vardır ve bu dalga boylarında hücrelere daha az yıkıcı. Yeşil fluorophores (emisyon maxima ~ 525 nm) kullanılabilir, ancak bakım fototoksisite hücrelere sınırlamak için alınması gerekir. Dalgaboyu daha az 480 heyecanlandırmak Fluorophores nm (mor ve mavi) yüksek fototoksisite ve diğer fluorophores29çamaşır suyu bu uyarma boyları için eğilimi nedeniyle kaçınılmalıdır. Mümkün olan yerlerde, yüksek-aydınlık ve istikrarlı fluorophores seçilmesi gerekir. Benzer şekilde, görüntü edinme parametreleri photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için ayarlanması gereken — Örneğin uzun pozlama düşük uyarma yoğunluğu, daha yüksek uyarma yoğunluklarda48tercih edilir. Rutin gibi antioksidanların eklendiğini ve kaldırıldığını bazı medya bileşenlerinin her iki photostability geliştirir ve fototoksisite49azaltır. Hatta dikkatli seçimi ile fluorophores ve görüntüleme koşulları photobleaching kez sınırlamak gerek düşük sinyal-gürültü oranı (bkz Şekil 5 örnek için) ile görüntüleri yakalama gerektirir. Floresan yoğunluğu miktarının, büyük bir özenle görüntü işleme eserler sınırlamak için alınması gerekir; ideal olarak, pişmemiş imge işleme olmadan herhangi bir analiz edilmelidir. Miktar önce görüntüleri deconvolving, floresan yoğunluklarda korur bir deconvolution algoritması kullanılan50,51olması gerekir.
Canlı hücre satın almalar özellikle, başarılı deneyler uyarma yoğunluğu, çekim hızı, kare hızı ve deneme süresi arasında dikkatli bir denge gerektiren zorlu bir iş olabilir. Uyarma yoğunluğu ve pozlama zaman fototoksisite uzun pozlama süreleri hareket eserler hücre hareketi nedeniyle neden veya satın kare hızı sınırı ihtar ile yukarıda açıklandığı gibi en aza indirmek için ayarlanmalıdır. Kare hızı deneysel gereksinimlerine bağlı olarak değişebilir. Daha düşük kare hızları (5-30 dk çerçeveler arasında) uzun süreler (12 saat veya daha fazla) üzerinde görüntüleme için izin ancak zar dinamiği ve post-efferocytosis efferosomes kaçakçılığı gibi olayları en düşük düzeyde veri sağlamak. Yüksek kare hızları (hızlı saniyede 1 kare olarak) efferocytic olaylar ve efferosome kaçakçılığı mükemmel zamansal çözünürlük sağlar — ama bile fluorophores, uyarma yoğunluğu ve pozlama süreleri dikkatli seçimi ile — photobleaching veya fototoksisite genellikle bu deneyler için bir saatten az süre sınırı olacaktır. Deneyim, her 1-2 dk görüntüleri elde üzerinde deneysel süreleri 2-6 h efferocytic olaylar, yeterli sayıda ölçülebilir görüntüleri ile makul zamansal çözünürlük sağlar kabul edilebilir bir uzlaşma vardır.
Değişmiş ve başarısız olan efferocytosis kanser, ateroskleroz ve birden çok otoimmün hastalıklar patoloji dahil olmak için bilinen, efferocytosis hedefleme terapileri ile gösteren büyük klinik7,52, söz 53,54,55. Bu alanlarda daha da geliştirilmesi kimlik ve hücresel süreçler, reseptörleri ve efferocytosis düzenleyen sinyal yollar karakterizasyonu gerektirir. Bu protokol için sunulan tahlil bu çalışmalar için güçlü bir araç temsil eder ve birçok efferocytosis düzenleyen hücresel ve sinyal gönderme işlemleri ölçmek için değiştirilebilir.

Apoptozis veya programlanmış hücre ölümü, en çok hücreli canlılar arasında oluşur ve onların gelişme ve homeostasis1için son derece önemli bir son derece düzenlenir fizyolojik süreçtir. Ek olarak normal hücre ciro ve embriyonik geliştirme dahil olmak, apoptozis dokular enfekte veya hasarlı hücreleri ortadan kaldırılması sağlar ve yanıt enfeksiyon, inflamasyon, kanser ve aynı zamanda tıbbi müdahaleler tarafından tetiklenebilir radyoterapi veya steroid1gibi. Apoptotik hücreleri göstermek "ye-bana" fagositler, profesyonel ve profesyonel olmayan bir dizi reseptörler tarafından tanınan sinyalleri onların hücre yüzeyinde topluca "efferocytes" anılacaktır. Bu reseptörler nişan alımı ve apoptotik hücre bozulması efferocyte efferocytosis2,3bilinen işlem aracılığıyla tarafından neden olmaktadır. Fosfatidilserin en iyisi karakterize yemek-sürüş efferocytosis işaret. Normalde plazma zarı iç broşür böylece açığa Fosfatidilserin hücre yüzey4' te bu membran asimetrisi bozan bir lipid scramblase aktive apoptozis ile sınırlanır. Fosfatidilserin olgun makrofajlar gibi bazı sigara apoptotik hücre hücre dışı yüzeyinde bulunan ve trombosit aktive. Ancak, bu hücreler efferocytosed "beni yeme" gibi sinyallerini CD47, onların hücre yüzey5,6,7varlığı nedeniyle değildir. Maruz Fosfatidilserin efferocytic reseptörleri efferocytes tarafından ifade edilen bir dizi tarafından kabul edilmektedir. Bu reseptörler Fosfatidilserin için bağlama, doğrudan veya opsonins, yardım yoluyla etkinleştirir apoptotik hücre engulfment efferosome8, olarak adlandırdığı bir membran bağlı çarpıtması içine teşvik sinyal yolları 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sırayla endosomes ile sigortalar ve Moleküler makineler efferosome acidify ve apoptotik aşağılamak için gerekli teslim organellerin hücre kargo13,14. Bir kez bozulmuş, apoptotik hücre kaynaklı malzemeler için geri dönüşüm endosome ticareti — bir süreç olan bağışıklık yanıtı apoptotik hücre kaynaklı antijenleri için sınırlar ve hangi apoptotik hücre13, besin kurtarma için izin verebilir 15. Engelli izni efferocytosis sonuçlarında apoptotik hücre bir başarısızlık; temizlenmemiş bu hücreler sonunda sekonder nekrozis tabi. Nekrotik hücre pro-inflamatuar sitozolik İçindekiler, patojenler ve autoantigens böylece driving range infektif, enflamatuar ve otoimmün hastalıklar16,17ekstraselüler ortamın yayın. Birlikte, apoptozis ve efferocytosis ölmek üzere olan ve ölü hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırmak ve doku homeostazı bakım için izin.
Efferocytosis temel moleküler mekanizmaları araştıran apoptotik hücre Alım açık bir miktar sağlamak üzere yöntemler gerektirir. Bu miktar diğer alımını mekanizmaları endositoz ve fagositoz18,19, efferocytosis gibi sağlam hedef hücre, parçalı Anlamazdın kaynaklanan engulfment neden olabileceğini değil aslında tarafından karmaşıktır apoptotik hücre efferocyte20. Burada açıklanan protokolü sağlar internalized doğru tarif bir vitro efferocytosis tahlil açıklar karşı bireysel apoptotik hücre bölümleri sigara içselleştirilmiş ve sabit-hücre çeşitli ile kombine edilebilir ve Live-cep mikroskobu yaklaşımlar. Geleneksel fagositoz deneyleri eklemek antikorlar Özel Sigara içselleştirilmiş hedefleri, nerede bizim yöntemi olarak etiketlemek için deney sonunda fagositik hedefe farklı kovalent bağlı biotin21 apoptotik hedefle etiketleme , 22. apoptotik hücre belirli antikor-ebilmek var olmak kullanılmış bu tahlil ederken, biotinylation yaklaşım herhangi bir protein taşıyan hedef etiketlenmeye olanak sağlar ve immunostaining gerçekleştirilirse ikincil antikor olan ile olası sorunları önler . Özellikle, bir hücre izleme boya ve biotin ile çift lekeli edilmiştir apoptotik Jurkat hücreleri hazırlanması anahat. Boya izleme hücre efferocytosis sırasında izleniyor, efferocytosed apoptotik hücre sigara içselleştirilmiş bölümlerden ise yüzey biotinylation ayrımcılık için sağlar internalized apoptotik hücre kaynaklı malzeme sağlar. Ayrıca Kültür ve hazırlanması J774.2 ve THP-1 hücre hatları için fare ve insan efferocytes olarak kullanmak, monosit kaynaklı M2 makrofajlar birincil hücre efferocytosis ve Jurkat hücreleri kullanmak için bir örnek olarak efferocytic hedef olarak açıklar. Bu yöntemler diğer hücre hatlara veya primer hücre, hücre ölümü (Örneğin apoptosis, nekroz ve necroptosis) her türlü geçiren hedef hücrelere ve hangi apoptotik hücreler lipid kaplamalar arasında taklit mikron büyüklüğünde taklit eder kolayca uygulanabilir veya kaplama ligandlar belirli bir faiz efferocytic takımı ile.
Bu protokol için özetlenen yöntemi yaygın olarak kullanılan alan23,24akış sitometresi dayalı yöntemler üzerinde birçok avantajı vardır. NET her iki toplam ve sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi etiketleme ile kombine Fagosit-apoptotik hücre etkileşimi doğrudan görüntüleme tarafından efferocytosis nicel ölçüleri yapılabilir. Ayrıca, pH-duyarlı fluorophores bazı alternatif yöntemler25zihnimi karıştıran lizozomal pH FITC ve GFP floresans bastırılması gibi karıştırıcı faktörlerin kısıtlar. Son olarak, ayrıntılı olarak açıklanmıştır değil iken, bu yöntemler transgenes, fluorescently etiketli ifade efferocytes kullanarak istihdam edilebilir veya sonrası fiksasyon immunostaining molekül etkinlik sinyal ve izlenmesi miktar için izin vermek için ile hücresel süreçler sırasında efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Efferocytosis Yönetmeliği okuyan ve doğru bir şekilde apoptotik hücreler alımını ölçmek için efferocytosis kontrol sinyal ve hücresel işlemleri soruşturma için yöntemler gerektirir. Bu miktar böylece doğru bir şekilde apoptotik hedef karşı artık unengulfed cep efferocytosed kısmı arasında betimlemek Yöntemler gerektiren çoğu kez efferocytosed parça parça, apoptotik hücreler gibi yapmak zor olabilir parçaları. Burada özetlenen yaklaşım doğru makrofajlar gibi efferocytes efferocytosis ve efferocytic kapasitesini dinamikleri ölçmek için çift etiketleme yaklaşımlar kullanır. Apoptotik hücre sitozol apoptotik hücre yüzey biotinylation farklılaşma için sağlar internalized ve sigara içselleştirilmiş arasında iken tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler, izleme özelliğini etkinleştirme bir hücre izleme boya ile etiketlenir apoptotik hücre kesirler. Canlı ya da sabit hücre floresan fotoğraf çekmek ve streptavidin boyama tarafından Ayrıştırılan gibi ilişkili içselleştirilmiş hedefleri karşı miktarı miktarının efferocytes efferocytic kapasitesini belirler. Bu yaklaşım yöntemleri akış sitometresi, yani efferocytosed apoptotik hücre kesirler, efferocytic dynamics tarafından canlı-cep mikroskobu, ölçmek için yetenek karşı efferocytosed doğru tarif gibi birçok avantaj sunar ve hücresel fluorescently etiketli transgenes ifade hücrelerde sinyalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kapasite. Birlikte, bu protokol için özetlenen yöntemleri doğru efferocytic etkinliğini ölçmek ve hücresel sinyal yolları efferocytosis sırasında etkin sorguya çekmek için kullanılan esnek bir deneysel yaklaşım için temel olarak hizmet vermektedir.

Gecede 1 µM staurosporine sonuçlarında apoptozis ile Jurkat hücre kültür > Annexin (Şekil 1) boyama V ile teyit edilmesi hücrelerin % 95'i. Staurosporine konsantrasyonu ve staurosporine tedavi süresi her hücre satırı için optimize edilmiş olması gerekir, ancak diğer hücre tipleri bu deneyler için kullanılabilir. Güvenilir algılama ve efferocytosis, miktar için > hücrelerin % 80'i-meli var olmak efferocytes için eklemeden önce apoptotik. Apoptozis (Örneğin Isı şok, etoposide ve UV ışığı) diğer indükleyicileri de kullanılabilir, ancak deneyim, bunlar daha heterojen bir indüksiyon apoptozis ve apoptotik, ikincil nekrotik içeren karma hücre popülasyonlarının sonucu üretmek ve apoptotik olmayan hedef hücreleri.
Sabit-hücre görüntüleme Inside-out boyama ile yakından apposed efferocyte-apoptotik hücre etkileşimleri açıkça belirlendi sigara-efferocytosed (boya+izleme streptavidin+/cell) ile tüm zaman noktalarda dikkat edilmelidir ve efferocytosed (streptavidin-/cell+izleme) malzemeler görülebilir (Şekil 2). Formları efferocyte ve apoptotik hücre arasında sinaps genellikle streptavidin dışlamak için sıkı olduğunu ve böylece onun çevresi üzerinde herhangi bir noktada streptavidin taşıyan nesne lekeli boya izleme herhangi bir hücreyi düşünülmelidir unutmamak gerekir bir hücre ve bir efferosome bağlı. Çoğu deneylerde efferocytosed apoptotik hücreler kısmını bir saat-bağımlı moda, hiç sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemeleri kalıncaya kadar veya en fazla efferocytic kapasitesini (Şekil Fagosit ulaşıncaya kadar artacak 3). Analizi genellikle gerçekleştirilen ve tek tek hücreler için (Şekil 3A) kaydedildi, ancak, veri içinde bireysel deneyleri ve birden çok deneysel tekrarlar ile geleneksel analiz ortalama değerleri hücreler boyunca ortalama istatistiksel yaklaşımlar (Şekil 3B). Birincil hücre tipleri, alternatif efferocytic hedefleri, kullanımı ve dahil edilecek ek boyama için izin vermek için bu standart protokol değişiklik yapılabilir. Örneğin, Şekil 4 oluşan efferocytosed apoptotik hücre taklit eder 3 µm çapı silis boncuk Fosfatidilserin bir karışımı olarak kaplı ve phosphatidylcholine28ardından, olan bir birincil M2 polarize insan makrofaj gösterir sonraki fiksasyon, permeabilization ve immunostaining geri dönüşüm endosome işaretçisi Rab17 için.
Sırasında canlı hücre efferocytic profesyonel fagositler Imaging genişletmek ve küçük bir işlem süreçlerinde geri çekmek için30 "algılama" olarak adlandırdığı gözlenir (5 rakam, t = 0); Bu işlemler bir hedef karşılaştığınızda sıkıca hedefe uygun ve hücre için çizmek. Bu yoklama etkinliği ile profesyonel olmayan fagositler epitel hücreleri gibi gözlenen değil. Efferocyte sonra sıkı bir oluşturacak "efferocytic sinaps"32 kendisi ile sık sık Zarflama apoptotik hücre büyük bir bölümünü bu synapse apoptotik hücre arasındaki (5 rakam, t = 10). Efferocyte sonra onun sitozol (Şekil 5, 10-30 dk) bu synapse apoptotik hücre parçalarını çizecektir. Yakında düzenlerini sonra yeni doğmakta olan bu efferosomes sinaps uzak ve peri-nükleer alan, aracılı Rab7/RILP/dinein-dynactin taşıma33sonucu doğru insan ticareti. Zaman içinde efferosomes küçülür ve büyük olasılıkla neredeler hücre yeniden dağıtılabilir elde edilen bozulmuş malzeme absorbe veya13,15geri dönüştürülmüş. Bu işlemler algılama yeteneğini edinme kare hızı ve deneme süresi son derece bağlıdır. Sondalama gibi hızlı işlemler değil gözlenen düşük kare-hızlarında, yavaş Olaylar (efferosome kaçakçılığı ve emme) daha uzun görüntüleme süre gerektiren süre — her iki durumda da, bu büyük görüntü alımları genellikle daha düşük yoğunluktaki görüntüleri yakalama gerektirir photobleaching ve fototoksisite (Şekil 5) sınırlamak için. Sabit-hücre tahlil ile bu tahlil canlı hücre sürümü araştırmacı gereksinimlerine uyacak şekilde değiştirilebilir. Şekil 6 hangi fluorescently plazma zarı (am-GFP) demark ve hangi seçmeli olarak sinyal lipid PI (3) P (FYVE-RFP) bağlar transgenes ifade J774.2 makrofajlar canlı hücre edinimi tek bir kare gösterir. PI (3) P nesil efferosome membran üzerinde FYVE-RFP Co yerelleştirme PM-GFP+ efferosome membran ile olarak tespit edilebilir. Efferosome FYVE-RFP yoğunluğuna miktarının tarafından PI (3) P efferosome üzerinde sinyal dynamics sayılabilir (Şekil 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58149/58149fig1.jpg"> Şekil 1: apoptotik Jurkat hücreleri ve apoptotik V boyama Annexin. V annexin Fosfatidilserin etiketleri "ye-bana" apoptotik hücreler tarafından maruz sinyal. (Üst) Tedavi edilmemiş (UT) Jurkat hücreleri bir sağlıklı (düz ve yuvarlak) morfoloji (DIC) görüntülemek ve (alt) Annexin V. Jurkat gecede 1 µM staurosporine (STS) ile kültürlü hücreleri bir apoptotik morfoloji (düzensiz ve blebbed) almak ve ile leke ile leke değil Annexin f. ölçek çubuğu 10 µm, = görüntü yoğunluğu renk eşleme olarak görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58149/58149fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58149/58149fig2.jpg"> Şekil 2: apoptotik Jurkat erken ve geç Engulfment J774.2 makrofajlar tarafından hücreleri. Bir erken (60 dk) ve efferocytosis geç (120 dk) aşaması, makrofajlar, görüntülerdir. Beyaz ışık (DIC) görüntü makrofaj (mφ) ve apoptotik hücre (AC) arasında sıkı arabirim gösterilmektedir. Boya (CTD, kırmızı) izleme hücre tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler konumunu ortaya koymaktadır. FITC Streptavidin (Str, yeşil) boyama henüz makrofaj tarafından yuttu değil apoptotik hücre olan kısmını tanımlar. Makrofaj hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile önceden lekeli. Efferosomes (kırmızı) karşı apoptotik hücre (yeşil/sarı) Sigara içselleştirilmiş bölümünü kolayca Streptavidin ve boya görüntüleri izleme hücre bir bindirme tanımlanır. Streptavidin streptavidin dışlama sıkıca kurulan efferocytic sinaps (*) üzerinden yarattığı erken timepoint makrofaj-apoptotik hücre arayüzü, boyama, olmadığına dikkat edin. Makrofaj çekirdeği (mavi) boyama Höchst tarafından tanımlanır. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58149/58149fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58149/58149fig3.jpg"> Şekil 3: zaman-apoptotik hücre Efferocytosed J774.2 makrofajlar tarafından kısmını tabii. Efferocytosis deneyleri gerçekleştirilen için belirtilen süreleri ve boya/Streptavadin boyama izleme hücre kullanarak her zaman noktada belirlenen yutulmak apoptotik hücre malzemesi kısmını. (A)kesir efferocytosed malzeme bireysel makrofajlar içinde veri sunulan tek tek hücreler, ortalama gösteren yatay bir çubuk görünür. koşul, 1-5 bağımsız deneyler veri başına 12 – 17 hücreleri. (B) kesir efferocytosed malzemelerin ortalama 5 bağımsız deneyler arasında en az 10 hücreler/durum/tekrarlama. p < 0,05 30 dk, Kruskal-Wallis testi Dunn düzeltme ile karşılaştırıldığında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58149/58149fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58149/58149fig4.jpg"> Şekil 4: Rab17 işe alım için Efferosomes birincil insan makrofajlar içinde analizini. M2 polarize makrofaj apoptotik hücre taklit eder (oklar) sardı ve 60 dk engulfment takip immunostained Rab17 (yeşil) için yapıldı. Ölçek çubuğu = 5 µm. hücre çekirdeği Hoeschst ile lekeli, DIC görüntü hücre morfolojisi gösterir ve apoptotik hücre taklit eder tanımlamak için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58149/58149fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58149/58149fig5.jpg"> Şekil 5: canlı hücre efferocytosis tahlil. Boya (AC, kırmızı) izleme farklı renk hücresiyle etiketli bir apoptotik Jurkat hücre yuttu gibi boya labeledJ774.2 makrofaj (mφ, yeşil) izleme hücre kaydedildi. Apoptotik hücre birden çok parçaya parçalı alımı ve birden çok efferosomes (oklar) oluşumu ile sonuçlanan içselleştirilmesi işlemi sırasında ayrılır. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58149/58149fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58149/58149fig6.jpg"> Şekil 6: floresan Transgenes Efferocytic sinyal araştırmak için kullanarak. J774.2 makrofaj GFP öğesini plazma zarı marker (PM, yeşil) ile transfected ve sinyal lipid bağlar FYVE-RFP yapı PI (3) P (kırmızı). Efferocytosis FYVE-RFP işe alım (ok) tarafından tespit gibi PI (3) P, içeren yeni doğmakta olan bir plazma zarı kaynaklı efferosome oluşturur. PI (3) P sinyal dynamics yoğunluk FYVE-RFP sinyal efferosome kapatma noktasında mevcut göreli kat olarak sayılabilir (t = 0, grafik). Bu deneme bir apoptotik hücre taklit eden boncuk (ok, DIC) apoptotik hücreler yerine kullanılan. Ölçek çubuğu 5 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58149/58149fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Görüntüleme.  University of Western Ontario. Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Video: Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.