We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy.">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li><li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ.">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+coming+of+age:+from+concepts+to+biological+impact.">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li><li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization.">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types.">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124 (2013).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol.">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li><li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+syringe.">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation.">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li><li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium.">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li><li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules.">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking.">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods.">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001 (2010).</li><li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes.">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li><li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET.">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li><li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion.">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Çoğu parametre hücre elektroporasyon ve veri toplama ilgi biyolojik sisteme ve deney (hücre düzeyinde ya da tek-molekül analizi) kesin doğasına bağlı olarak sırasında değiştiirlebilir. Bakteri içine DNA elektroporasyon Örneğin, işaretlenmiş dsDNA parçalarının 0,25-5 pmol (daha önce ışıkla ağartma gerek kalmadan örneğin.) Doğrudan tek moleküllü tespitine olanak sağlayan, düşük bir içselleştirme verimliliği sağlanır. 5 pmol dsDNA üzerinde, hücreler ağırlıklı olarak tek bir hücre analizi için bir rejim daha uygun yüklenecek eğilimindedir. Bütün etiketlenmiş DNA&#39;lar aynı zamanda, daha önce jel-saflaştırılmış serbest boyanın izlerini tamamen yok etmek için olması gereken bir DNA stok çözeltisinden (floroforu reaksiyona girmemiş). Ayrıca, özellikle smFRET deneyler için DNA bozulması, potansiyel sorunlar, doğal olmayan nükleik asitler, ya da firkete döngüler gibi eksonükleaz erişilebilir terminallerini koruyan motifli DNA&#39;lar kullanılarak ele alınabilir. Başka Ayarlanamazelektroporasyon e parametresi elektroporasyon sırasında uygulanan alan gücüdür. Düşük alan gücü (yaklaşık 1 kV / cm), tek bir molekül çalışmalar için uygun olan düşük bir yükleme veriminin düşmesine sebep olacaktır. (1.8 kV / cm kadar) yüksek alan kuvvetleri yükleme verimliliğini artıracak; Bununla birlikte, elektroporasyon sonra kapsama alanı ve hücre canlılığı arasında ters bir ilişki vardır (bakınız Şekil 4). Referans için, bakteri ve mantar için elektroporasyonu için kullanılan normal bir alan kuvveti ~ 1.5 kV / cm&#39;dir. zaman sabiti damla kısa sürede herhangi bir ark fenomen küvet içinde meydana gibi beri bu çürüme uzunluğunu temsil eden zaman sabiti, takip için uygun bir parametredir. Normal ayarlar altında, zaman sabiti 4 ms daha büyük olmalıdır; düşük değerler düşük yükleme verimliliği ve hatta olmayan yüklü hasarlı hücrelerin yol açacaktır. En electroporators iki ayarlamak için değiştirilebilir (örneğin, &quot;darbe kesme&quot; veya &quot;şekli darbe&quot; gibi) serbestlik diğer derecelerde teklifHücre yükleme ve canlılık. Ancak biz benzer prosedürler de, bunların zar (tek lipid iki-tabakalı) gerçekten de daha kolay ve elektroporasyon artık bu tür hücreleri ile kullanıldığından uygun Electroporator ayarlarını kullanarak memeli hücrelerine etiketli biyomoleküllerin içselleşmesini izin vermelidir, hem bakteriler ve maya için, bu yöntemi tatbik 21. Etiketli proteinlerin içe, tüm serbest boya işaretli protein, stok çözelti, önce elektroporasyon arasından çıkarılması gerekiyor. Ücretsiz boya molekülleri nedeniyle kendi küçük boyutu, ilgi proteinlerin üzerinde tercihen içselleştirilmiş ve (beklenen hızlı difüzyon rağmen) veri analizi sırasında ayırt etmek zordur edilebilir. Organik etiketlenmiş proteinin bir numune için bir rehber, elektroporasyon için uygun olduğu gibi, serbest boya kalan miktarı% 2&#39;nin altında olması gerekir 22 (SDS-PAGE floresan taraması kullanılarak tespit edilir). Bu işlem, özellikle önemlidirBazı moleküller Electroporated bakteri veya maya dış zarlarında sopa olabilir gibi. Bu bağlamda, negatif kontrol örneği (herhangi bir floresan etiketli biyomoleküller ile inkübe de elektroporasyona edilmemiş hücreler, Şekil 2) boş hücre otofloresan seviyesi ideal olarak, düşük elektroporate edilmiş hücrelerde açıkça daha düşük hücre başına floresan yoğunluğu, göstermesi gerekir. DsDNA gibi, etiketlenmiş proteinlerin içselleştirme verimliliği elektroporasyon önce hücrelere ilave biyomoleküllerin miktarı ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, bu boyut ve şarj gibi diğer parametreler, içselleştirme bir rol oynar. Küçük proteinler büyük proteinlerin etmiştir (Şekil 5) 26 (98 kDa kadar) başarılı bir şekilde içselleştirilebilir, ancak daha düşük bir randımanla, yüksek içselleştirme etkinliği düşüktür. protein izoelektrik nokta, hücre zarı ile potansiyel etkileşimler ve diğer fizikokimyasal parametrelerelektroporasyon sırasında etkisi hücre yükleme. Sonuç olarak, kullanıcılar etiketli protein (&gt; 50 mcM) yüksek başlangıç ​​konsantrasyonu başarılı yükleme için en iyi şans vereceğini bilerek, kendi sistemi için deneyler optimize etmek gerekir. Elektroporasyon da perturb ve hücrelerin (ya etiketli veya etiketsiz) içine proteinleri ve diğer biyomoleküllerin getirerek hücresel fonksiyonu analiz için yeni bir araç sunar. Bu, T7 RNA polimeraz deneyleri (Şekil 5C) Bu elektroporasyon kullanılarak in vivo gen ekspresyonunu değiştirmek için bir biyomolekülün neden olabilir bir deney gibi bir örnek. Tek-molekül floresan deneyler yaparken bu lamel yüzeyi (~ 100 nm) üzerinde ince bir bölüm içinde heyecan verici tek floroforlar en iyi sinyal-gürültü oranı sunuyor gibi, TIR aydınlatma genellikle diğer aydınlatma modları üzerinde tercih edilir. Ancak yaşayan mikroorganizmaların içinde difüzyon görüntüleme etiketlenmiş biomoleküller yeniden olabilirquire derin aydınlatma (yukarı, E. coli için 0.8 um). Yüksek sinyal-gürültü oranı muhafaza ederken daha derin aydınlatma, HILO modunda elde edilir. Diğer taraftan, geniş alan görüntüleme kullanıcının yüksek lazer gücü ile bütün bir yüklü hücre ışıkla ağartma ve üretilen yekpare yoğunluğu ile ilk hücre floresan yoğunluğu bölünerek içsel moleküllerinin sayısını tahmin etmek olan aşamalı bir ışıkla ağartma analizi için özellikle önemlidir tek bir molekül (bir ışıkla ağartma aşamasında, Şekil 3) ile incelenmiştir. Kendi yörüngeleri tüm hücre hacmi kapsayacak bile Widefield görüntüleme da ilgi difüzyon molekülleri lokalize etmek amacıyla uzun vadeli molekülü takibi için gereklidir. Bu protokol, elektroporasyon, hücrelerdeki nükleik asitlerin sağlanması için biyologlar ve biyokimya için standart bir teknik, farklı hücre tiplerinde floresan biyomoleküllerin verilmesi için basit bir yöntem teşkil ne sunulmuştur. Throman, yüksek verimli tekniği kendi doğal ortamında etiketli molekülleri gözlemlemek için eşsiz bir araç sunuyor. Flüoroforlar dalga boyu geniş bir kaplama ile etiketlenmiş ilaveli biyomoleküllerin olarak, doğal olmayan nükleotid ve amino asitler, metal kenetleme maddeleri, çapraz bağlayıcılar, ve tespit grupları gibi birçok kimyasal gruplar ile tadil edilmiş moleküller sağlamak elektroporasyon. İlgi biyolojik sistem hücre gelişimi için gerekli değilse içselleştirme sonra gözlenen proteinler, hücre içi protein havuzunun tüm (veya en) temsil sağlanması, hedef protein için gen kodlaması da silinebilir (veya sersemleyen) . Özünde, elektroporasyon &quot;nakli&quot; canlı hücrelere in vitro biyokonjugatlarda esneklik ve dolayısıyla sentetik biyoloji, sistem biyolojisi çabaları, ve in vivo tek-molekül tespiti yararlanabilir.

Canlı hücrelerin içinde çoğu floresan çalışmaları gibi GFP 1 gibi floresan proteinleri (FP), protein füzyonları bağlıdır. Bu floresan etiketler, gen ekspresyonu ya da zar taşıma 2-7 gibi süreçlerde rol oynamaktadır proteinlerin kopya sayısı, difüzyon desen veya lokalizasyon çalışmaları sağlar. FP yüksek etiketleme özgüllük, kolay uygulanmasını teklif, ve çeşitli fotofiziksel ve kimyasal özellikleri 1 çeşitlerinin büyük bir envanter vardır. Bununla birlikte, organik flüoroforlar da daha fazla foto-nedeniyle, in vitro deneyler için birincil seçim kalır (kadar FP daha stabil 100 kat) 8,9, küçük boyutlu (en küçük FP daha hacmi 100 kat kadar) ve molekül içi etiketleme kolaylığı (esas olarak sistein artıklarının kullanımı yoluyla). Tüm bu faktörler tek-molekül floresan için özellikle önemlidir ve FRET 10 inceler. Çeşitli içselleştirme yöntemleri combinOrganik etiketleme ve in vivo tespiti avantaj ing son on yıl içinde kullanılmaya başlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntem, doğal olmayan amino asitler 15 kullanılmasını gerektirmektedir, ya da örneğin, (büyük, tek-zar ökaryotik hücreler ile sınırlıdır, göreceli olarak büyük polipeptitlere etiketler (örneğin, TMP, halo, ya da 20 kDa&#39;lık SNAP etiketleri) 11-14 kullanmak ya da. , yükleme, şırınga yükleme, mikroenjeksiyon) 16-19 kazımak. Bu protokol, in vivo gözlem ile çiftler organik florofor avantajları yeni, basit ve yüksek verimli içselleştirme yöntemi tarif etmektedir. Bu tekniğin geliştirilmesi için, genel olarak, örneğin E.Coli gibi mikroorganizmalar yüklemek için plazmid DNA 20,21 ile hücrelerini dönüştürmek için kullanılan elektroporasyon prosedürü adapte E. coli veya S. organik etiketli biyomoleküllerle cerevisiae. protokol 4 basit adımlardan oluşur: hücrelerinin inkübasyon etiketli biyomoleküllerle,elektroporasyon, hücre kurtarma ve hücre yıkama olmayan içselleştirilmiş biyomoleküllerin kaldırmak için. Burada, bu elektroporasyon protokolü, hem de hücre bazlı ve tek molekül floresan çalışma ve sinyalleri FRET hücre görüntüleme ve veri analizi işlemleri sunmaktadır. Elektroporasyon biyomoleküllerin (Şekil 1) 20,21 hücreleri girebileceği geçici zar gözenekleri oluşturmak için düşük iyonik güçlü bir hücre süspansiyonu üzerinde bir yüksek gerilim elektrik alanı boşaltma dayanır. Sadece plazmid DNA ile bakteri transformasyonu veya maya gibi, hücreler electrocompetency sağlamak için elektroporasyon önce hazırlanmalıdır gerekir. Bu işlem, su ile birkaç yıkama aşamasından oluşan zar geçirgenliğini artırır ve elektroporasyon küveti içinde bir kavisi önlemek için hücre çözeltisinin iyonik mukavemeti azaltır. Bu protokol, hücrelerin (protokol bakınız: 1.1), aşağıda tarif edildiği gibi hazırlanabilir ya da ticari sağlayıcıdan satıns. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Şekil 1: içselleştirme protokolünün şematik temsili Soldan sağa:. Elektro-güçlü hücreler (çift-etiketli DNA fragmanları ve bu örnekte bakteri) kana etiketli biyomoleküllerin birkaç mikrolitre ekleyin; buz üzerinde 1 ila 10 dakika inkübe edilir ve önceden soğutulmuş elektroporasyon küvetine transfer; electroporate ve daha sonra hemen sonra hücrelere 0.5-1 ml zengin orta ekleyin; Hücreler dinlendirin 37 ° C (veya organizma için gerekli sıcaklık, örneğin, maya için 29 ° C) inkübe; herhangi bir aşırı olmayan içselleştirilmiş etiketli molekülleri kaldırmak için 5 yıkama adımları gerçekleştirin; PBS tamponu ve pipet bir agaroz ped 10 ul 100-200 ul nihai pelet tekrar süspansiyon; (geniş alan modu veya HILO modunda) bir floresan mikroskop üzerinde bir temizlenmiş lamel ve görüntü ile pedi kapağı. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; Elektro hücreleri en biyokimya laboratuarlarda bulunan standart electroporators kullanılarak yapılabilir sadece elektroporasyon önce etiketlenmiş biyomoleküller ile inkübe edilir. Hemen Elektroporasyondan sonra, hücreler, yıkama önce iyileşme (Şekil 1) sağlayan bir zengin ortam içinde inkübe edilir. olmayan içsel etiketli biyomoleküllerin fazlalığı ilk olarak bir tuz, oldukça yüksek konsantrasyonda ve bir deterjan ihtiva eden bir tampon içinde yıkanarak uzaklaştırılır (3.3 protokolü). tuz varlığı, aksi takdirde dış zar üzerinde yapışabilir olmayan içselleştirilmiş etiketli biyomoleküllerin tarafından oluşturulan non-spesifik elektrostatik etkileşimleri bozar. Benzer bir şekilde, yıkama tampon maddesi içinde deterjan varlığı spesifik olmayan hidrofobik etkileşimler bozar. DNA içselleştirilmesi (Şekil 2) basit iken, önlemler elektroporasyon kullanılarak etiketli proteinleri içselleştirilmesi zaman alınması gereken. İlk olarak, organik işaretlenmiş proteinin hazır numune hala serbest boyanın küçük bir yüzdesini içerebilir. Serbest kalan boya molekülleri protein göre çok daha küçük ve bu nedenle tercihli olarak içselleştirilebilir olabilir. Gözlenen içsel floresan moleküllerin büyük çoğunluğu ilgilenilen proteinin uygun olduğundan emin olmak için, ilk protein örneği az 2 ila en fazla% serbest boya (Şekil 5) 22 içermesi gerekir. olmayan içselleştirilmiş etiketli proteinlerin aşırı ayrıca elektroporasyon sonra dış hücre zarı sopa; Bu olgu, protein-spesifik ve her yeni protein için kontrol edilmesi gerekmektedir. Biz (: 3.3.3 PROTOKOL bakınız) Yüklenen hücre örneği olmayan içselleştirilmiş proteinlerin kaldırılmasını sağlayacak çeşitli seçenekler önermek. Son olarak, hücreler, fosfat tamponu, küçük bir hacim içinde tekrar süspanse edilir ve flüoresanlı bir mikroskop üzerine görüntüleme sağlayan bir agaroz ped üzerine damlatıldı. Agaroz pedleri İmmobilizasyonu bir simplE ve bütünlüğünü zarar vermeden bir lamel hücreleri görüntülenmesi etkili yolu. ped düşük floresan kültür ortamı ihtiva etmelidir. Hücre görüntüleme ya Widefield içinde, toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya Hilo kullanarak (Yüksek Eğimli ve Lamine Optik Levha) mikroskopi yapılabilir. HILO yapılandırmada, lazer ışını, daha büyük bir sinyal-gürültü oranı 23 sağlayan, geniş açılı gibi, örneğin tamamına yanmaz henüz TIRF daha numunenin içine derin nüfuz eder. Kullanılan lazer gücü ve zaman çözünürlüğüne bağlı olarak, içselleştirilmiş biomoleküller, (Şekil 3 kademeli-photobleaching analizi kullanılarak) sayılır lokalize veya 24-28 izlenebilir. Flüoroforların bir FRET çifti ile iki kez işaretlenmiş yapıların içselleştirme tek bir hücre ya da tek-molekül seviyesinde (Şekil 6), FRET iki ölçümü sağlar. Farklı parametreler değiştirilebiliristenen çıktı ve çalışılan bir biyolojik sisteme bağlı olarak değişebilir. İlk olarak, hücre başına içsel malzeme miktarı Hücreler, steril elektroporasyon (Şekil 2) eklenmiştir etiketli biyomoleküllerin konsantrasyonunun değiştirilmesiyle ayarlanabilir. Elektroporasyon alan şiddeti de yükleme verimliliği ve hücre canlılığı hem etkileyecektir; Beklendiği gibi, artan kuvvet alanı ile birlikte yükleme verimliliği artar ise, elektroporate edilmiş hücrelerde yaşayabilirliği (Şekil 4A) azalır. Her iki parametre de yüklenen yüzdesini kayıt ve elektroporasyon sonra hücrelerin bölünmesiyle hesaplanabilir. Floresan görüntüleme ile birleştiğinde bu canlılığı tahlil de canlı hücrelerde içselleştirilmiş biyomoleküllerin gözlem doğrular ve birkaç kuşak (Şekil 4B) üzerinde sürekli gözlem sağlar. Özet olarak, bu protokol fosforla etiketlenmiş DNA ve protein moleküllerinin içselleşmesini içine sağlarE. coli veya S. cerevisiae&#39;de 26. Organik fluorophores etiketli Bireysel moleküller büyüklükte bir sipariş daha uzun hekimleri daha zaman çizelgesi için yüksek uzaysal çözünürlüğü ile izlenebilir. Son olarak, bu yöntem, geniş açılı, TIRF ve konfokal tespiti, hem de bu tür ALEX (lazer uyarma 28,29 sırayla değişen) ve darbeli uyarma yapısı ile uyumlu değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Örnek hazırlanması protokol farklı adımlar, Şekil 1 &#39;de şema olarak sunulmaktadır. Bir örnek olarak, çift etiketli (donör ve alıcı boyalar), DNA fragmanları ile bakteri yükleme temsil etmektedir. DNA internalizasyonundan Örnek sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. Her bir elektroporasyona numune için, boş hücreler olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde için veriler (bakınız Şekil 2) kaydedildi. &quot;Boş hücreler&quot; ne floresan biyomoleküllerin ne elektropore ile kuluçkaya hücreleri elektrouyumlu karşılık; floresan kanalda kendi yoğunluğu aynı deneysel koşullar (lazer gücü, zaman çözünürlüğü, sıcaklık, vb) kapsamında otofloresans seviyesini yansıtır. &quot;Non-Elektroporasyona tabi tutulan hücreler&quot; (diğer bir deyişle -EP, yani, eksi AP) hücreler, floresan biomolec ile inkübe edilmiştir elektrouyumlu olan bir negatif kontrol tekabültim ama elektropore değil. Bu non-Elektroporasyona hücreler boş hücrelerin otofloresansı benzer ve yüklü, Electroporated hücreler tarafından görüntülenen floresan yoğunluğu önemli ölçüde daha düşük bir floresan seviyesi göstermelidir. Bu dış hücre zarına yapışmış olabilecek herhangi olmayan içselleştirilmiş etiketli biyomoleküllerin kaldırılmasını onaylar. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg" /> Şekil 2: bakteri farklı konsantrasyonlarda farklı floroforlar ile etiketlenmiş dsDNA&#39;nın içselleştirme (AE) ve maya (F) için Temsilcisi sonuçları sağa Sola:. Beyaz ışık, floresan ve bindirme görüntüler. - / + EP elektroporasyon ile / olmadan inkübasyon gösterir. Ölçek çubukları: 3 mikron. C. Cy3B dsDNA, 10 pmol E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol E. coli. C Alexa647 dsDNA, 5 pmol E.coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E.coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol Maya. Bu rakam referans 26 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Hücre başına içselleştirilmiş biyomoleküllerin sayısını sayma işlem, birbirine Etiketli DNA farklı konsantrasyonları ile elde edilen temsili sonuçlar, Şekil 3 ve Yardımcı film 2 içinde sunulmaktadır ışıkla ağartma analizi kullanılarak hücre başına içsel etiketli biyomoleküllerin sayısını tahmin etmek. Hücre yükleme verimliliği kuluçkaya etiketli DNA başlangıç ​​miktarı artar, bir &quot;tek-molekül&quot; seviyede (&lt;10, Ek Film 2B) bir &quot;topluluk&quot; seviyesine (&gt; 10 den ayarlamak için kullanıcıya hücre başına etiketli moleküllerin sayısını izin , Ek Film 2A). Yüklenen hücrelerin yüzdesini tahmin bir sağlam yol to, olmayan Electroporated hücrelerin ortalama hücre yoğunluğu artı 3 kat standart sapma (yani, Av (I-EP) + 3 * StdDev (I-EP) Av = ortalamanın üzerinde bir hücre yoğunluğu görüntüleme Electroporated hücrelerin sayısını I = piksel şiddeti, std. Dev. = standart sapma ve -EP = olmayan elektroporasyona), Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg" /> Şekil 3:. Photobleaching analizi kullanılarak içselleştirilmiş moleküllerin sayısını sayma (A) Tek hücreli analizi photobleaching. Floresan yoğunluğu timetraces örnekleri (mavi: ham veri; kırmızı: fit; ekler: WL öncesi ve beyazlatma sonrası ATTO647N-etiketli dsDNA&#39;ya yüklü E. coli floresan görüntüleri). En: Tek adım beyazlatma olay. Orta: ağartma gösteren ± 3 molekülleri ihtiva eden hücreve yanıp sönen. Alt: En az 10 moleküllere tekabül&gt; 10 adım içeren hücre az 6 ayırt adımlar içeren 57 hücrelerinden otomatik adım uydurma algoritması tek adım yüksekliği yoğunluklarının (B) Histogram.. Tek-Gauss uyum saniyede 8100 fotonların bir üniter fluorofor yoğunluğu karşılık, 11 ± 3 au merkezli edilir. yıldız üstünde veya üniter fluorofor yoğunluğu ile ilk floresan yoğunluğu bölünmesi sonra hesaplanan ATTO647N dsDNA&#39;nın farklı miktarlarda ile electroporated hücre başına içselleştirilmiş moleküllerin eşit 50 au (C) Histogram tüm basamak yükseklikleri toplama bin işaretler. Alt en: boş hücreler (örneğin, floresan moleküller ile inkübe değildir ve elektroporasyona olan) non-elektroporasyona (ancak floresan moleküller, adı -EP ile inkübe) ve elektroporasyonlu hücreler, 10 ve 100 pmol (EP + adlandırılır) dsDNA inkübe edildi. Boş ve olmayan electroporated hücreleri karşılıkotofloresansı için, elektroporasyona ise hücreler (≥ 4 molekülleri yıldız işaretli bin bakınız), 100 pmol de yüksek yüklü hücrelerin daha yüksek bir oranda içsel bir molekül, geniş bir dağılım göstermektedir. Içselleştirme verimi 10 ve 100 pmol numuneler için (Int hücrelerin oranı. + 3x std. Dev. Sigara -EP numunenin ortalama&gt;) sırasıyla% 94 ve% 90 idi. 10 pmol dsDNA için 121 ± 106 molekülleri ve 100 pmol dsDNA için 176 ± 187 moleküller: Hücre başına içselleştirilmiş moleküllerin sayısını ortalama. Ayarlar: 100 ms pozlama, geniş açılı aydınlatma. Ölçek çubukları: 1 mikron. Bu rakam referans 26 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Hücre yükleme ve canlılığı Etiketli biyomoleküllerin miktarının değiştirilmesi ek olarak önce elektroporasyon hücrelere ilave,Kullanıcı elektroporasyon sırasında (Şekil 4, Ek Film 1) farklı alan güçlerini seçerek ayar içselleştirilmiş moleküllerin miktarını yapabilirsiniz. Yüksek alan kuvvetleri daha içselleştirilmesi verimlilikleri yol, ancak hücre canlılığı hafif azalmaya yol. Protein içselleştirilmesi için, bir filtrasyon adım kullanımı olmayan içselleştirilmiş etiketli proteinleri (3.3.3.1.1 bakınız) giderilmesine yardımcı olabilir. Bu gibi durumlarda, hücre filtrasyon gözlenen floresan proteinleri gerçekten bakteriyel sitoplazma içinde içsel sağlar; Biz (Daha fazla bilgi için, REF 22) Ancak, bu filtrasyon de hücre canlılığı üzerine olumsuz etkisi vardır, unutmayın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg" /> Şekil 4: Hücre yükleme ve canlılığı üzerine elektroporasyon gerilim Etkisi (A) yükleme effic üzerinde elektroporasyon alan gücü etkisini temsil eden Çubuk grafik.iency (kırmızı çubuklar) ve hücrelerin (yeşil çubuklar) canlılığı. 37 ° C&#39;de bir agaroz yastığı 1 saat sonra olmayan elektroporasyona hücre (0 kV / cm) bölme 84 ±% 8. Aynı koşullar altında, 78 ±% 3 ve 0.9 kV / sm ve 1.8 kV / cm elektroporate edilmiş hücrelerde 49 ±% 3, sırasıyla 1 saat sonra bölün. Hücrelerin 92 ± 6% 1.8 kV / cm yüklenir yüklenirken verimi için, hücreler 73 ±% 8, 0.9 kV / cm yüklenir. Hata çubukları üç bağımsız ölçümlerinden hesaplanan standart sapmayı temsil eder; 200&#39;ün hücreler her bir numune ve her tekrar için analiz edilmiştir. Birkaç nesil boyunca hücre canlılığı hafif zararına elektroporasyon gerilimi ile genel yükleme verimi artar. (B) Hücre bazlı floresan ölçümleri genel floresan yoğunluğu hem kızı hücreleri arasında eşit olarak paylaşılır olduğunu göstermektedir. Hücre 1 ve 2 t = 0 Ölçeğinde (solda) beyaz ışık görüntüdeki hücre sayısı ve floresan görüntü anlamına gelirBar: 1 mikron). Bu şekil, başvuru 26 modifiye edilmiştir. Protein içselleştirme Protein içselleştirilmesi için Temsilcisi sonuçları Şekil 5A &amp; B vardır. Mümkün önce elektroporasyon gibi protein örnek geri kalan serbest (tepkimeye girmemiş) boya kadar çıkarmak için özellikle önemlidir. Şekiller 5A ve B, Cy3b etiketli Klenow Fragment örnek (KF, E. coli DNA polimeraz I Klenow fragmanı olduğu Cy3b-KF, 66 kDa), sadece% 1 serbest boyasını içeren örnekler ise; genel hücre yükleme gibi boya katkısı ihmal edilebilir. Serbest boya eşdeğer bir miktarı ile elektropore (etiketli protein aynı miktarı ile kuluçkalanmıştır) olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde hem de ilgi elektroporasyona numune karşılaştırma olarak hücreler gözlenen floresan moleküller sağlamak için gerekli olan iki kontrolleri teşkilgerçekten etiketli proteinleri içselleştirilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg" /> Şekil 5: canlı bakteri protein içselleştirilmesi (A) görüş Temsilcisi floresan bindirme alanı.. Hücreler sadece% 1 bedava Cy3b boyası içeren bir protein stok çözeltisinden 50 pmol rnap ω alt birimi ile 1.4 kV geriliminde elektropore. Sigara Elektroporasyona (non -EP) ve boş hücreler, daha önce olduğu gibi tanımlanır. Serbest kalan boya rnap ω Electroporated örnekteki gibi aynı konsantrasyonda internalize edildi. 1 mW, (A) numuneleri için düzeltilmemiş hücre ortalama yoğunlukları 50 ms maruz kalma. (B), dağıtım de geniş alan modu, 532 nm uyarım Imaging, toplam hücre sayımı oranı verilmiştir. Numune başına 400&#39;den fazla hücre dilimli edildi. Bu rakam referans 22 modifiye edilmiştir. Unla (C) içselleştirilmesibir T7 promoterinin kontrolü altında, pRSET-EmGFP plazmid kodlayan zümrüt GFP (EmGFP) taşıyan elektro DH5a içine Beled T7 RNA polimeraz (T7 rnap, 98 kDa) sahiptir. Sol: tahlil şematik. Orta: floresan bindirme. Sağ: kuluçkalanmıştır ve T7 rnap (alt) ile elektroporasyona olmayan elektroporasyona örnek (üst) ve hücreleri için hücre bazlı floresan yoğunluklarının histogram; Electroporated hücrelerin yaklaşık% 11 yüksek floresan yoğunluğu göstermektedir (Int hücrelerin fraksiyonu.&gt; + ortalama 3x Std. Dev. dışı -EP numunesinin) EmGFP ifadesini göstermektedir. 3 um: yıldız üzerinde veya eşit 1,100 au Ölçek çubuğu tüm yoğunlukları toplama kutuları gösterir. Bu şekil, başvuru 26 modifiye edilmiştir. Şekil 5C proteini elektroporasyon başka bir uygulama sunuyor. Burada, Electroporated protein etiketsiz, ama onun içselleştirilmesi gözlemlenebilir floresan yanıtı tetikler. Bu deney öncesi doğrularSense ve hücre sitoplazması içinde elektro proteinlerin işlevleri. Etiketsiz T7 RNA polimeraz (98 kDa) E. içine içselleştirilmiş edildi bir T7 promotörü 26 kontrolü altında floresan protein EmGFP için bir plazmid kodlayan ihtiva eden E. coli suşu DH5a. T7 RNA polimeraz için gen DH5a içinde mevcut olduğu gibi, deneylerde EmGFP sentezleme fonksiyonel T7 RNA polimerazı, elektroporasyon (Şekil 5C) ile hücrelere dahil olmasını gerektirir. 1 umol T7 rnap hücrelerin&gt;% 11 ile elektroporasyon tarafta (mavi bar, Şekil 5C), negatif kontrol daha yüksek flüoresans sergilemiştir (T7 rnap aynı miktarı ile inkübe ancak elektroporasyona yok). Bu sonuç, elektroporasyon tarafından içselleştirilmiş T7 rnap moleküllerinin bir kısmının in vivo kendi bütünlüğünü korumak ve hücre sitoplazmasında amaçlanan işlevlerini gerçekleştirebilirsiniz kurar. In vivo tek molekülün de FRETve tek hücre seviyeleri Son olarak, canlı bakteri çift etiketli türlerin içselleştirme ve analiz 3. Adı floresan protein füzyonları, in vivo smFRET çalışmalar için ideal değildir, Şekil 6 ve ek film sunulmuştur, elektroporasyon kullanılarak canlı hücreler içine iki kez işaretlenmiş biyomoleküllerin iletme kabiliyeti biridir Bu yöntemin büyük varlıkların. Şekil 6A tek hücreli (donör-alıcı FRET çifti olarak Cy3B ve Atto647N fluorophores kullanarak) farklı FRET DNA standartları ile yüklenen bakterilerin analizi FRET sunuyor. Hücreler 0.17, 0.48 görünen FRET verimliliği ile üç kısa çift etiketli dsDNA FRET standartlarının 20 pmol (E *) ile electroporated edilir ve 0.86 in vitro (daha önce 26 belirlenir). Tüm DNA&#39;lar (Şekil 6A, sol) ve her tek hücreli E * dağılımının ana zirve verimli hücrelerine girmek (in vitro sonuçları ile de Şekil 6A kabul, Sağ). Orta ve yüksek FRET örneklerde, düşük bunun nedeni, muhtemelen alıcı ağartma ve Fotofiziksel hareketsizlik, değişken hücre yükleme kombinasyonuna gözlenir beklenenden daha E * (bu nedenle, değişken bir sinyal-gürültü oranı) ve DNA bozulmasıyla hücre popülasyonları . <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg" /> Şekil 6,.:., Tek hücre ve tek molekül için Örnek sonuçlar Topluluğu ve smFRET çalışmalar tek bakteri yaşayan bakteri içinde gözlem FRET düşük sergileyen her biri üç DNA FRET standartlarının 20 pmol yüklü hücrelerin (A) Analizi (~ 0.17) ara madde (~ 0,48) ve yüksek (~ 0.86), FRET (in vitro tek molekül ölçümleri kullanılarak ölçüldüğünde REF 26). Sol: beyaz ışık ve yeşil / kırmızı (FRET) floresan bindirme görüntüleri (Ölçek çubuğu: 3 mikron). Farklı hücrelerden FRET değerlerin örnekleri (beyaz) gösterilir. Teçhizat<html> (yukarıdan aşağıya) ht:. düzeltilmemiş hücre tabanlı FRET (E *) DNA standartlarını FRET donör sadece (koyu yeşil), düşük (açık yeşil), ara (sarı), ve yüksek (kırmızı) için histogramlar (B-D) in vivo smFRET içinde. Hücreler 0.25 pmol orta FRET DNA (panel B), 0.25 pmol yüksek FRET DNA (panel C) ile yüklenir, ve 5 pmol KF (panel D), çift etiketli. Sol sütun: öncesi ve alıcı photobleaching sonra tek bir kare yeşil / kırmızı floresan bindirme. Orta sütun: sarı daire içinde molekülün karşılık gelen zaman izleri. FRET verimliliği, donör emisyon yoğunlukları ve alıcı emisyon yoğunlukları sırasıyla, mavi, yeşil, kırmızı ve görüntülenir. Sağ kolon: donör sadece moleküller (yeşil) ve her bir numune için 20 kez izlerinden (sarı, kırmızı ve gri) donör-alıcı molekülleri FRET histogramlar. Ölçek çubukları: A 3 um, B-D-1 um. Bu şekil, başvuru 26 modifiye edilmiştir.208fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. DNA ya da protein, orta ve yüksek-FRET DNA standartları örnekleri, düşük miktarlarda (0.25 umol) (Şekil 6B, C) ​​ya da, FRET çifti çift etiketli KF (Alexa647 / Cy3B fluorophores 5 pmol Şekil için in vivo olarak smFRET gözlemlemek 6D) E. elektroporasyona tabi olan coli. Bu konsantrasyonlar izleme ve tek moleküllerin izlenmesi FRET, doğrudan yerelleştirme izin birkaç (n = 1-10) etiketli molekülleri ile yüklenen birçok hücrelere yol açtı. Diğerleri hareketsiz görünür veya yavaş (Ek Film 3) yaygın ise bazı moleküller, serbestçe yayılır. 1-30 saniye sürer ve smFRET ayırt edici göstermektedir hareketsizleştirilmiş çift etiketli biyomoleküllerin (Şekil 6, ortada) Timetraces: Örneğin alıcı ağartma üzerine donör ve akseptör floresansta anticorrelated değişimleri (t ~ 16 saniye; Şekil 6B, orta ), tek ardından(örneğin, t +; 19 saniye; Şekil 6B), aşama verici ağartma. Bu tür timetraces (Şekil 6, sağ) in vitro çalışmalar, 26,31,32 yayınlanan ile mükemmel bir uyum içinde olan, bir ortalama değer sonuç elde FRET dağılımlar. Bu sonuçlar içselleştirilmiş DNA&#39;lar ve proteinler üzerinde kantitatif smFRET çalışmaları için yeteneği kurmak, ve (T7 rnap içselleştirilmesi deneyleri tarafından desteklenen) proteinleri elektroporasyon ve içselleştirilmesi üzerine kendi bütünlüğünü ve yapısını korumak öneririz. Ek Film 1:. Hücre canlılığı Sol: Beyaz ışık görüntüleri. Sağ: floresan görüntüler. Hareketli GIF 10 pmol Atto647 işaretlenmiş DNA ile yüklü bakteri elektroporasyon (1.8 kV / cm) sonra ayrımı gösteren animasyonlu. floresan genel belirgin düşüş kısmen her sırasında meydana photobleaching da hücre bölünmesi üzerine etiketli DNA seyreltme nedeniyle ve birölçümü. Ek Film 2: Hücre bazlı photobleaching çalışmaları A.. (&gt; 100 Atto647N etiketli DNA moleküllerini ihtiva eden) bir ağır yüklü hücre Örnek örneği. En sol, faiz (kırmızı dikdörtgen) bir hücrenin beyaz ışık görüntüsü. En doğru, birkaç dakika içinde kendi floresan çürümesine gösteren yüklenen hücrelerin film. Ilgi hücrenin genel floresan yoğunluğu çürüme Bottom, zaman iz. Organik flüoroforlar yaşam süreleri FP daha yüksek büyüklükte 2 sipariş (burada ~ Atto647N 41 sn), ışıkla ağartma sergileyebilir. En az 10 işaretli moleküllerin (bu durumda 3) ile yüklü bir hücre B. Örnek örneği. Paneli A. Bottom, tek aşamalı ağartma gösteren ve / veya tek organik floroforlar karşılık gelen yanıp sönen ilgi hücrenin genel floresan yoğunluğu zaman izi ile aynı Üst,. Bu adımların ortalama yüksekliği ~ burada (tek-molekül üniter yoğunluğuna karşılık12 au) hücre başına içselleştirilmiş moleküllerin ilk sayısını tahmin etmek için kullanılmıştır. 300 uW güçte sürekli kırmızı lazer uyarma altında Filmler ve kare başına 100 ms. Ek Film 3:. Ben n tek-molekül FRET En vivo: Hücreler sürekli nTIRF aydınlatma altında kare başına 50 ms izlenir 0.25 pmol (Şekil 6C gibi) yüksek FRET DNA 1 mW yeşil (532 nm) lazer kullanarak yüklü. Her kare, her kanalda bir yeşil / kırmızı (FRET) floresan bindirme olduğunu. Difüzyon ve hareketsiz kırmızı (bozulmamış) ve yeşil (tek aktif etiket) DNA molekülleri görülebilir. Alt: sarı daire içinde molekül gelen Zaman iz. FRET verimliliği, donör emisyon yoğunlukları ve alıcı emisyon yoğunlukları sırasıyla, mavi, yeşil, kırmızı ve görüntülenir. Anti-ilişkili alıcı ağartma olayı (kırmızı-yeşil-geçişler için) tek-molekül FRET imzalanmasından karşılık gelir.

Watch this Scientific Journal Video about Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation at JoVE.com

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Görüntüleme.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Video: Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Biyoloji

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi,<em&gt; Orijinli olanlar</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...