Yazarlar uzman teknik destek için Amnis Corporation&#39;ın (EMD Milllipore parçası) Cincinnati Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı ve Richard Demarco, Sherree Arkadaşlar, ve Scott Mordecai de Araştırma Sitometrisi Core teşekkür. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen K08HL088126 ve R01HL116352 (TAK) verir ve P30 DK090971 (YZ).

Vitro Eritropoez Kültür 1. Uzun vadeli (Ex vivo eritroid Farklılaşma Kültür Protokolü Giarratana ve ark. Tarafından 8 Modifiye ve Fare Hücreler için uyarlanmıştır) Bu vitro eritropoezi protokolünde bir 3 adım uzun bir terimdir. İlk aşamada (gün 0-4) 2 x 10 5 hücre / ml kök hücre faktörü (SCF), interlökin-3 (IL-3) ve eritropoietin (EPO) ile desteklenmiş büyüme ortamında erythroblast yerleştirilir. İkinci aşama (gün 5-6), hücreler 2 x 10 &#39;de yeniden süspanse edilir 5 hücre / sadece Epo ile desteklenmiş taze erythroblast büyüme ortamı içinde yapışkan stroma hücreleri (MS5) hakkında ml, co-kültürlenmiştir. Üçüncü aşamada (gün 7-9) &#39;de, hücrelerin kadar enükleasyonuna sitokinlerin (Şekil 1A) olmadan taze erythroblast büyüme ortamı içinde MS-5 hücreleri bir tabaka üzerinde kültürlenmiştir. Tüm hayvan protokoller Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmışCincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi. <ol><li> Kemik ve düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerinin izolasyonu hasat <ol><li> 2 ml, 15 ml konik bir tüp içinde% 2 fetal sığır serumu (FBS) ihtiva eden steril IMDM ekleyin ve buz üzerinde tutun. </li><li> (Servikal dislokasyon örneğin CO 2 inhalasyon) kurum onaylı protokol aşağıdaki (veya ilgi genetik hedefli fare olmadan birlikte) 2-6 aylık yabani tip C57/BL6 fare Euthanize. </li><li> , Forseps ve neşter kullanılarak leğen kemikleri, femur ve her iki bacak fibula izole IMDM 2% FBS içeren tüp ekleyin ve buz üzerinde tutmak. </li><li> (25-G x birkaç kez yavaşça kemikler yoluyla 5/8 &quot;iğne. Flush IMDM +% 2 FBS ile forseps ve bir tüberkülin şırıngası kullanılarak bir steril akış sitometri tüp ve gömme kemiklerde 1 ml IMDM +% 2 FBS ekleme Hücre süspansiyonundan 500 ul ~ ve aspire) kemiği tekrar yıkama ve akış cytometr içine, kemik iliği hücreleri toplamak iley tüpü. Kemikler, beyaz göründüğünde Flushing tamamlandı. </li><li> 50 ml konik tüp üstünde bir 40-um hücre filtresi grubu boyunca hücre süspansiyonu filtre. IMDM +% 2 FBS ve aynı ortam 5 ml hücre süspansiyonu son seviyesini ayarlamak kullanılarak hücre süzgeç yıkayın. </li><li> Yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile, düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerini (ldbm) hazırlayın: dikkatlice orta 1,083 g / ml 750 x g, 15 ml&#39;lik bir tüp ve spin 25 için yoğunluk gradyan hücre ayrımı, 5 ml on hücre süspansiyonu 5 ml katman dk hayır fren / düşük bir ivme ile oda sıcaklığında (RT). </li><li> Aktarım süpernatan (her kadar 15 ml tüp içinde 2 ml işareti ince beyaz tabakayı elde etmek için ilgili olarak), yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe ve 5 dk boyunca 525 x g &#39;de IMDM +% 2 FBS ile bir kez daha yıkama yerine RT. </li><li> Aspire edilen süpernatan ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3 ml RBC liziz tamponu içinde süspanse pelet olarak kalan herhangi bir kırmızı kan hücrelerini (RBC) lize edildi. Erythroblasts daha büyük bir saflık ise(Biyokimyasal çalışmalar için) örneğin, son aşamada gerekmektedir, manyetik ayırma ile Lin negatif hücrelere bu aşamada daha fazla ldbm hücrelerin saflaştırılması. </li></ol></li><li> Ldbm ya da Lin negatif hücrelerin başlangıç ​​Ex vivo erythroid farklılaşması kültür protokolü (Şekil 1A) <ol><li> Ekle 7 ml IMDM +% 2 FBS, 5 dakika oda sıcaklığında ve aşağıdakilerden oluşan, 2 mi erythroblast büyüme ortamı (EGM) &#39;de pelet hücreleri tekrar süspansiyon için 525 x g&#39;de santrifüj: a. Ihtiva eden StemPro-34 ortamı, b. 2.6% StemPro-34 orta ek, c. % 20 BIT-9500, d. 900 ng / ml demir sülfat, e. 90 ng / ml demir nitrat, f. 100 ünite / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin g. 10 -6 M hidrokortizon h. ve taze eklenen sitokinleri: i) 100 ng / ml SCF, ii) 5 ng / ml IL-3, ve iii) 3 IU / ml EPO. </li><li> Bir kenar ile bir otomatik hücre sayacı kullanılarak ya da el ile mikroskop de hücre sayımıocytometer. </li><li> / Oyuk EGM içinde, 2.5 ml (2 x 10 5 ldbm hücre / ml) bir son hacim ve 37 ° C&#39;de inkübe 5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda, 6-yuvalı hücre kültürü plakasının Levha (bu kabul edilir kültürün gün # 0 gibi). </li><li> , Süpernatan aspire 1.5 ml, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 525 x g, iplik 3 sitokinler ihtiva eden ve 2. gün geri çukurlara her gün taze ortam ilave 1.5 ml ortam içinde yeniden süspansiyona ile değiştirme, 3, 4, optimize çoğalma fazı. 3. günde, bütün hücrelerini kaldırmak saymak ve ~ 2 x 10 5 hücre / ml de hücre konsantrasyonları sürdürmek için kuyu uygun sayıya bölünür. 37 ° C /% 5 CO 2 kültürünü korumak. </li><li> 4. günde, yeni bir hücre kültür 6-çukurlu bir levhanın çukurlarına plaka MS5 hücrelerinin (murin hücre hattı). MS5 hücre kültür ortamı,% 20 FBS ihtiva eden, 100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin, MEM-α edilir. </li><li> 5. günde, sayı saymak, otomatik bir hücre sayacı ya da el ile bir hemositometre kullanılarak bir mikroskop ile kullanarak, orijinal kültür plakasının her çukuruna hücreler (şimdi önemli ölçüde eritroblastta zenginleştirilmiş). </li><li> Her kuyudan tüm hücreleri kaldırın ve 15 ml konik tüplere aktarın, oda sıcaklığına, aspirat yüzer, 5 dakika boyunca 525 x g hızında aşağı spin ve 2 x 10 bir konsantrasyona kadar sadece Epo (3 IU / ml) ihtiva eden taze EGM ile granül çözülür 5 hücre / ml. </li><li> MS-5 hücreleri bir önceki gün, (ko-kültür esnasında 70-80% konfluansa kadar hedefli) kaplama ve tek EPO içeren EGM bu kuyularda eritroit hücreleri eklemek takımından kuyulardan aspire süpernatan (değil orta bölgesinin her ne seçim, MS-5 hücreleri) birkaç gün EGM iyi hayatta. </li><li> Gün içerisinde 6. taze EPO ekleyerek orta değiştirin. </li><li> Hiçbir ekledi sitokinler ile EGM kullanarak, günlük # 7 orta değiştirin. Günlerde 7 ile 9, sitometri günlük anti-Ter119 ve Syto-16 ile boyanarak ve p sonra akışı ile enükleasyon için test örnekleriMulti-Spektral Görüntüleme Sitometrisi (3. bölümde ayrıntılı olarak) için numune boyama için roceed. Not:. Günde 2, 4, 6, ve kültür on 7 kaplama ve önce sitometri boyutu (FSC) vs yüzey belirteçleri CD44 ve Ter119 değerlendirerek akışı ile erythroblast zenginleştirme ve farklılaşması için kültür hücreleri izlemek 9 Alternatif CD71, Ter119 ve FSC Ayrıca, 10, 11 kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Hızlı Enükleasyon Assay, Yoshida ve arkadaşları tarafından tanımlanan Protokolüne göre. Değişiklikler 12 (Şekil 1B) <ol><li> In vitro eritropoezi kültürü Stres erythropoiesis indüksiyon ve stroma hücre hazırlama <ol><li> IACUC kurallarına başına 2-6 aylık bir vahşi tip C57/BL6 fareyi (örn. izofluran çözeltisi ile) anestezisi. Fare yeterince nazik bir arka-pençe tutam refleksif tepkilerin olmaması için ve kontrol ile anestezi edilmiş olduğundan emin olunİşlem sırasında normal solunum. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner oftalmik merhem kullanın. </li><li> 500 ul son hacim olması için kuyruk kanatması yoluyla eritrosit stres neden. Bir insülin şırınga kullanarak, periton hayvanın sıvı resüsitasyon (enjekte önce Trendelenburg pozisyonda hayvan tutun ve iç organlara zarar vermemek için alt karın enjekte) sağlamak için normal tuz eşit miktarda enjekte. </li><li> Kafesin etrafında hareket etmeye başlayan ve düşmeden durmak ve yürümek mümkün olan hayvan tarafından belirtildiği gibi motor kontrol kavuşana kadar sahipsiz fareyi bırakmayın. Phlebotomized fare, diğer fareler olmayan bir kafese yerleştirilir. </li><li> 2 gün sonra, 24-gözlü hücre kültür tablası çukurundaki MS-5 hücreleri plaka. MS5 hücre ortamı içinde 37 ° C /% 5 CO2 ile MS-5 hücreleri inkübe (a-MEM% 20 FBS ihtiva eden, 100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin) amacı ile 70-80 olduğu % confluent i48 saat sonra n plaka kuyuları. </li></ol></li><li> Dalak ve splenositlerin işlenme hasat <ol><li> Dört gün (96 saat) stres eritropoez indüksiyon sonrası, önceden IACUC onaylı protokol (servikal dislokasyon örneğin CO 2 inhalasyon) yoluyla fare kanadı Euthanize. </li><li> Hasat dalak ve IMDM% 2 FBS içeren 15 ml konik tüp içine koyun ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Geri laboratuarda, steril koşullar altında, doku kültürü kaputu, 50 ml tüp üzerine oturtulmuş bir 40-mikron hücre süzgecinden dalak içeren tüp ters. 5 ml&#39;lik plastik şırınga pistonu kullanarak dalak ez. </li><li> IMDM +% 2 FBS ile hücre süzgeç yıkayın ve aynı ortam kullanılarak, 5 ml hücre süspansiyonu son hacim ayarlayın. </li><li> Dikkatle 5 ml yoğunluk gradyan hücre ayrılmasına 5 ml süspansiyon splenosit orta tabaka, fren / düşük bir ivme ile oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 750 x g&#39;de 15 ml tüp ve spin 1.083 g / ml. </li><li> Transferyeni bir 15 ml&#39;lik tüpe ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 525 x g &#39;de IMDM +% 2 FBS ile bir kez daha yıkama yerine supernatant (buffy coat elde etmek amacıyla, 15 ml tüp içinde 2 ml işaretine kadar yaklaşık çözelti) . </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3 ml RBC liziz tamponu içinde süspanse edilmesi suretiyle pelet süpernatan aspire ve kırmızı kan hücrelerinin lize. </li><li> Hücreleri yıkamak için ve seyreltilmesi ve, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 525 xg&#39;de RBC liziz tamponu ve spin nötralize 7 ml IMDM +% 2 FBS ekleme </li><li> Aspire edilen süpernatan ve erythroblast büyüme ortamında (EGM) 2 ml pelet hücrelerin süspansiyonu. </li></ol></li><li> Plastik eritroblastta zenginleştirilmiş izole düşük yoğunluklu splenositlerinin, (hızlı, in vitro erythropoiesis kültürünün ilk aşaması) Kültür <ol><li> Otomatik hücre sayıcı veya elle bir hemositometreyle hücreleri saymak. Bu aşamada, dalak başına izole edilen hücre sayısı olağan ~ 15 x 10 6&#39;dır. </li><li> F (sitokinler ihtiva eden daha başka EGM hücreleri Askıyainal konsantrasyonlar): SCF 50 ng / ml, IL-3, 5 ng / ml, ve EPO 2 U / ml. </li><li> / A 24-iyi hücre kültür plakasının 1 ml / oyuk (de, toplam hücre sayısına bağlı olarak ortalama hücre aynı sayıda) bir nihai hacim içinde ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe Plate 1-5 x 10 6 hücre % 5 CO 2. </li></ol></li><li> MS5 hücreleri üzerinde erythroblasts (hızlı in vitro erythropoiesis kültürünün ikinci aşama Kültür <ol><li> Aspire de plastikten süpernatan ve her bir kuyucuğa, buz üzerinde 5 dakika boyunca PBS içinde soğuk 10 mM EDTA, 2 ml eklenerek (son derece eritroblastta zenginleştirilmiş) hücreleri kaldırın. </li><li> (Sitokinler) olmadan EGM kez yıkama ve aynı tekrar süspansiyon, yeni tüplere hücreleri koyun. </li><li> Bir 1-2 ml hacim içinde Plaka 5 x 10 5 -1 x 10 6 hücre her MS5 hücre kaplı 24 yuvalı plakanın. Farmakolojik inhibitörleri deneyde kullanılan, şimdi uygun konsantrasyonlarda ekleyebilirsiniz. </li><li> Tarafından yönlendirilen 6 ila 8 saat (zaman inkübemuamele edilmemiş WT örneğinde yaklaşık 30% -40% enükleasyonunu) mikroskopik gözlem. MS-5 hücreleri için eritroblast bağlanma kendi enükleasyonunu hızlandırır. </li><li> Buz üzerinde 5 dakika boyunca, soğuk PBS + 10 mM EDTA, 2 ml ilave etmek suretiyle, her kuyudan alınan hücreler, kaldırın. Erythroblasts ile birlikte, MS-5 hücreleri de tahsil edilecektir ancak bu daha sonra kolayca FSC hi Ter119 gibi akış sitometri analizi sırasında dışlanan olabilir - hücreler. </li><li> Bu aşamada hücreler, multi-spektral Görüntüleme Akım Sitometrisi ile analiz için sabit ve boyanmış olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enükleasyon sırasında hücre içi proteinlerin veya lipid sallar Lokalizasyonlarının için eritroblastlarda boyanması <ol><li> PBS&#39;de hücreleri yıkayın 5 dakika oda sıcaklığında ve süpernatan aspire 525 xg dönerler. </li><li> (Tespit zaman anti-bağlı olarak değişebilir, 15 dakika boyunca PBS içinde% 3.7 formaldehit 500 ul hücre pelletleri yeniden süspanse hücreleri saptamakgen problanmış) ve yavaşça pipetleme ediliyor. </li><li> 1.5 ml&#39;lik plastik santrifüj tüplerine aktarılır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 20 saniye, aspire süpernatant ve yavaşça her tüp ve pipet 500 ul PBS ekleyerek bir yıkama gerçekleştirmek için bir tezgah mikrosantrifuj 2.000 xg Spin. </li><li> 20 sn, aspire süpernatant için bir tezgah mikrosantrifuj 2.000 xg üzerinde Spin ve en az 15 dakika boyunca buz üzerinde tüpler tutmak. Permeablization 3.6-3.9 hızlı ve verimli yapılması gerektiğini, ve oda sıcaklığında iplik / aspirasyonu takiben hücre topakları hemen hücrelerin daha iyi kendi bütünlüğünü korumak için sırayla, buz üzerinde geri koymak gerekir adımları. </li><li> -20 ° C dondurucu aseton çözümler alın ve buz koymak. Yavaşça 500 ul buz soğukluğunda% 50 aseton (2 O dH ile 1:1) pipetle ilk hücre pelletleri yeniden süspanse hücreleri geçirgenliği. </li><li> Tezgah mikrosantrifiijde Spin 500 ul 20 sn, aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet 2.000 xg60; hafifçe pipetleme buz soğukluğunda% 100 aseton. </li><li> Tezgah mikrosantrfuj on Spin hafifçe pipetleme 500 ul buz soğukluğunda% 50 aseton içerisinde bir kez daha 20 saniye, aspirat supernatant ve tekrar süspansiyon hücre topakları için 2000 x g. </li><li> Tezgah mikrosantrfuj Spin 2000 20 saniye boyunca xg, süpernatan aspire ve yavaşça pipetleme soğuk FACS tampon maddesi (PBS +% 0.5 BSA) içinde bir kere hücreleri yıkayın. </li><li> Ilgi molekülleri için antikorlar veya işaretleri ile etiketleme kokteyli hazırlayın: eritroid hücre boyama F-aktin boyama ve 1 μl/100 ul Ter119-PECy7 için 0.1 U/100 ul AF488-Phalloidin. Alternatif ya da ek boyama da (01:50), AF-594-konjüge edilmiş kolera toksin alt-B lipid sallar etiketlemek için (1:200), anti-pMRLC (Ser19) AF-488-anti-β-tubulin antikoru kullanılarak yapılabilir fosforile miyosin hafif düzenleyici anti-tavşan AF-488-konjuge ikincil antikoru (1:400) ve ardından zincir (1:50), ve anti-γ-Tomar yay için birincil antikorlin primer tavşan antikoru (1:100) anti-tavşan AF-555-konjuge ikincil antikoru (1:300) eklenmiştir. </li><li> Süpernatan aspirasyon sonra, yavaşça işaretleyici kokteyl, pipet, 100 ul hücre topakları tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Nükleer leke Draq5 2.5 mcM içeren FACS tampon hazırlayın. </li><li> Tezgah mikrosantrifiijde üzerinde Draq5 içeren 60 ul FACS tamponunda 20 saniye, aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon için 2.000 xg aşağı spin, FACS tampon hücreleri yıkayın. </li><li> Görüntüleme çalıştırın örnekleri görüntüleme özgü analiz yazılımı akış sitometresi kullanılarak, deney başına en az 10.000 olay toplamak, daha önce yayınlanmış 13 gibi ham veri dosyalarını telafi etmek, ve Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi sonuçlarını analiz etmek akış sitometresi. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+distribution+and+function+during+the+maturation+and+enucleation+of+mammalian+erythroblasts.">Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts.</a> J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).</li><li>Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+trafficking+plays+a+novel+role+in+erythroblast+enucleation.">Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation.</a> Blood. 116, 3331-3340 (2010).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Konstantinidis, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+cytoskeletal+requirements+in+erythroblast+enucleation.">Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.</a> Blood. 119, 6118-6127 (2012).</li><li>Giarratana, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).</li><li>Kalfa, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Rac2+GTPases+are+necessary+for+early+erythropoietic+expansion+in+the+bone+marrow+but+not+in+the+spleen.">Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen.</a> Haematologica. 95, 27-35 (2010).</li><li>Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells.">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Kırmızı kan hücrelerinin ex vivo başarılı bir şekilde, büyük ölçekli üretim elde etmek için etkili bir şekilde yeniden üretmek için çok zordur erythropoiesis in vitro kültürlerinde adım olduğu Son yıllarda erythroblast enükleasyonu çalışma artan ivme kazanmıştır. Son zamanlara kadar, erythroblast enükleasyonu çalışma esas floresan mikroskobu kullanılmaktadır ve sitometri yöntemleri akar. Floresan mikroskopi yöntemleri, katılımcı moleküllerinin belirlenmesi yard...

Memelilerde eritroid soy içinde terminal farklılaşma ortokromatik erythroblast bir retikülosit 2 üreten, kendi membran kaplı çekirdeği (pyrenocyte) 1 kovar hangi aracılığıyla enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. De başarılı oran-sınırlayıcı bir adımdır, bu prosesin mekanizması tam olarak, büyük ölçekli, in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimi, henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu floresan ve elektron mikroskobu 3-5 kullanımına dayanır. Bu işlem, tipik olarak sıkıcı enükleasyonu etkinlikleri sınırlı sayıda tanımlanması ile sonuçlanır ve her zaman anlamlı istatistiksel olarak analiz edilmesine izin vermez. McGrath ve ark. 6 tarafından tarif erythroblast kimlik bir yöntem üzerinde genişletilmesi, biz Multi-Spektral Ima tarafından enükleasyonun olayları tanımlama ve okuyan yeni bir yaklaşım geliştirdilerölçümler elde ve istatistiksel analizi gerçekleştirmek için gözlemler yeterli sayıda sağlayabilir retlendirici Sitometrisi (akımında multiparameter yüksek hızlı hücre görüntüleme, akış sitometrisine floresan mikroskopi birleştiren bir yöntem) 7. Burada, biz eritroblastlarda senkronize ve değerlendirilmesi sırasında enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak amacıyla kullanılan ilk iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar. Numuneler sitometresiyle bir görüntüleme akış üzerinde çalışan ve toplanan hücreler ortokromatik eritroblastlarda 6 tanımlamak için uygun Geçitli. Aydınlık İMA olarak ölçülen ortokromatik eritroblastlar sonra, onların boy oranına göre dağılımı incelendiğindeging sırasıyla Ter119 ve DNA için lekeli alanların merkezleri arasındaki mesafe olarak tanımlanan parametre delta ağırlık merkezi XY Ter119-DNA, için kendi değerine karşılık. Düşük en-boy oranına ve yüksek delta sentroid XY Ter119/DNA ile hücre nüfusu oldukça hücreleri enucleating zenginleşmektedir. - / - Veya kombine RAC2 - / - wild-tip (WT) kullanarak RAC2 üzerine Rac1 Mx-Cre aracılı koşullu silme ile erythroblasts karşı eritroblastlarda; RAC3 - / -, genetik geçmişi ve multi-spektral görüntüleme akışının bu yeni protokol sitometrisi analizi, son zamanlarda enükleasyonu asimetrik sitokinez ve benzer Rac GTPases kısmen düzenlenmiş bir aktomizin halkasının oluşumu enükleasyonu ilerlemesi 7 için önemli olduğunu ortaya koymuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Memelilerde Eritropoez retikülosit oluşumuyla sonuçlanan enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. Enükleasyonu mekanizması henüz tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Mikroskopla enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu okuyan karşılaşılan genel bir sorun enükleasyonunu geçiren hücrelerin yeterli sayıda gözlemlemek güçlüğüdür. Bu akışta çok parametreli yüksek hızlı hücre görüntüleme (Fazla Spektral Görüntüleme Flow Cytometry), verimli bir şekilde enucleating etkinlikleri önemli sayıda belirlemek amacıyla, akış sitometrisi ile immünofloresan mikroskopi bir araya getiren bir yöntemi kullanarak yeni bir analiz protokolü geliştirdik, bu sağlar: ölçümler elde ve istatistiksel analiz. Biz buraya ilk kemirgen eritroblastlarda senkronize ve inci de enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak için kullanılan iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri tarifdeğerlendirme e saati. Daha sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar. Büyüklüğü ve ortokromatik eritroblastlarda tanımlamak için kullanılır DNA/Ter119 boyama ile birlikte, ince uzun hücreleri ve &quot;delta ağırlık merkezi XY Ter119/Draq5 tanınmasına yardımcı olan, parlak-alan kanal bir hücrenin parametreleri&quot; boy oranı &quot;kullanmaktadır &quot;Bu Ter119 boyama (olgunlaşmamış retikülosit) merkez uzak Draq5 lekeleme (çekirdek yapılan ekstrüzyon) merkezinden olduğu hücresel olaylar, bu nedenle tanımlama aydınlatmak üzere bir hücre gösteren sağlar. Yüksek delta sentroidinden ve düşük boy oranı ile ortokromatik erythroblast nüfusun alt kümesi derece hücreleri enucleating zenginleşmektedir.

İlk olarak, hücreler aydınlık Boy Oranı (bunların büyük ekseni ile kendi küçük uzunluğunun oranı) ve aydınlık Alan (büyüklüklerine göstergesidir) göre analiz edilir. Bir aydınlık Alan Değeri 20 daha düşük ve 200 &#39;den daha yüksek olan olaylar sırası ile enkaz ve hücre agrega, ve analizi (Şekil 2A) için hariç tutulur. Tek hücreler (gate &quot;R1&quot;) daha sonra görüntünün keskinliğini gösterir Gradient RMS parametresi için, kendi değerine göre analiz vardı...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Görüntüleme.  University of Cincinnati College of Medicine.  Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder. 

Video: Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biyoloji

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.