Bu yöntem lipid membranları ile proteinlerin yönlerini çalışma yardımcı olabilir. Bizim durumumuzda, negatif yüklü fosfolipidler için annexins kalsiyum bağımlı bağlanması analiz etmek için kullanın. Bu tekniğin başlıca avantajları etiketsiz, hassas, nicel olması ve etkileşimlerin gerçek zamanlı olarak gözlemlenebildiğidir.
Böylece gerçek sonuçların doğrudan analizine olanak sağlar. Bu teknik, daha karmaşık mikromolekül derlemelerinin ve hatta hücrelerin etkileşimi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi açık beş milimolar lipid çözeltisi kullanın.
10 mililitrelik cam tüplerde istenilen molar oranında çözünmüş lipidleri birleştirin. Kuru bir azot akışı kullanarak organik çözücüleri buharlaştırın. Çözücülerin kalan izlerini gidermek için lipid karışımını üç saat boyunca yüksek vakumlu lyophilization sisteminde bırakın.
Şimdi, bir mililitre sitrat tamponuyla lipid filmini askıya alın. Bir su banyosunda 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede lipid süspansiyon kuluçka, şiddetle her beş dakikada girdap. Bu sıcaklık, karışımdaki en yüksek eriyen lipidin faz geçiş sıcaklığının yaklaşık 10 derece üzerindedir.
Bu arada, 30 dakika boyunca geçiş sıcaklığıüzerinde 50 nanometre çapında gözenek ölçekli polikarbonat membran ile donatılmış ekstrüder önceden ısıtın. Multilamellar vezikül süspansiyonunu önceden ısıtılmış ekstrüderin içine yükleyin. Karışımı polikarbonat membrandan 31 kez geçirerek küçük unilamellar veziküller veya SUV'lar oluşturun.
Sıcaklığı geçiş sıcaklığının üzerinde tutun. İki mililitrelik plastik reaksiyon kabına SUV süspansiyon aktarın ve iki mililitre son hacmi getirmek için sitrat tampon ekleyin. Politetrafloroetilen tutucuya en az 30 dakika boyunca %2'lik sds çözeltisi yerleştiren dört sensör yerleştirin.
Sonra tamamen SDS kaldırmak ve kuru argon veya azot akışı kullanarak denemek için ultra saf su ile yoğun olarak yıkayın. Herhangi bir kirletici maddeyi tamamen gidermek için plazma temizleme sistemi kullanın. Bunu yapmak için, plazma temizleme odasına kuru sensörleri yerleştirin, odayı boşaltın ve oksijenle üç kez temizle.
Sonra plazma temizleyicisini açın. Vakum, yüksek radyo frekansgücü ve 10 dakikalık işlem süresi kullanın. Temizleme çalışmasından sonra makineyi kapatın ve sensörleri çıkarTın.
Plazma temizlenmiş sensörleri cımbız kullanarak dört akış odasına dikkatlice sabitleyin. Sızıntıya neden olabilecek oda ve tüplerin üzerindeki herhangi bir baskıdan veya burulmalardan kaçının. Sistemi açık akış modunda 10 dakika boyunca sitrat arabelleğiyle temizleyin.
Programı başlatın. Frekans ve dağılım taban çizgileri kararlı olana kadar yazılımı kullanarak ilk temel tonu ve overtons frekans ve dağılmasında herhangi bir değişiklik kaydetmeye başlayın. Taban çizgileri sabit olduğunda, sitrat tampon u farzına SUV süspansiyonu uygulayın.
Bir reaksiyon kabı kullanarak, ölü hacmin 1,5 mililitresini çıkarın ve döngü akış modunda sistemi kapatın. Frekans dağılım değişimini 10 dakika daha kaydedin. SLB kararlı olduğunda, 40 dakika boyunca açık akış modunda gerekli kalsiyum konsantrasyonlarında çalışan bir tampon ile sistemi dengeleyin.
Kalsiyum içeren çalışan tampon protein ekleyin. Bir denge sabit durumuna ulaşınceye kadar bir döngü akış modunda protein in uygulama gerçekleştirin. Şimdi, açık akış modunda çalışan tampon beş milimolar EGTA ile kalsiyum iyonları şelat tarafından bağlı protein ayrıştırın.
Sürekli açık akış modunda 50 mililitre çift distile su ile mikro denge sistemini yenileyin. Tüpleri su kabından çıkarın ve sistemin kurumasına izin verin. Kristal sensörü dikkatlice çıkarın ve politetrafloroetilen tutucuyu kullanarak %2'lik bir SDS çözeltisi ile temizleyin.
Akış modülünün görünür kısımlarını sensörün yerleştirildiği iç kısımlarını kurutun. Burada gösterilen, frekans eğrisi ve dağılma vardiya kaydıdır. Lipozomların eklenmesi yle frekanstaki belirgin düşüş, tampon dolgulu veziküller sert değil viskoelastik olduğu için emilimlerini gösterir, dağılma artar.
Daha sonra, birleşen veziküller yırtılır. Veziküllerin içindeki tamponun eşlik eden salınımı, istikrarlı bir platoya ulaşılıncaya kadar adsorbe kitleyi azaltır. Annexin A2'nin lipidlere bağlanması, açık frekans kaymasında görüldüğü gibi kütle ekler, ancak dağılmadaki tek küçük değişiklikte belirtildiği gibi iki katmanlı yapıyı etkilemez.
Kalsiyum iyonu şelat etkeni, EGTA, Annexin A2 tarafından çıkarıldığında lipid filmden ayrıştırılır. Frekans ve dağılma kayıtları sadece Annexin A2 bağlanmasının tamamen kalsiyum iyonuna bağlı olduğunu ve lipid filminin bozulmadığını gösteren çift katmanlı olarak görülen seviyelere kayMaktadır. Temsili bir negatif kontrol deneyi burada gösterilmiştir.
Fosfatidilserin olmadığında kalsiyum iyonu varlığında Annexin A2'nin eklenmesinden sonra frekansta veya dağılımda herhangi bir değişiklik gözlenmez. Bu yordamı çalışırken, uygun iki katmanlı oluşumunu sağlamak önemlidir. Hemen lipozomlar kullanın, aksi takdirde küçük veziküller kararsız bir taban çizgisi ne yol açabilir daha az yüzey gerilimi ile daha büyük olanlar içine kaynaşacak.
Bu prosedürü takiben, kooperatif karşı kooperatif olmayan bağlama gibi ek soruları cevaplamak için bir membran protein etkileşiminin nicel bir açıklaması yapılabilir.
