Bu yöntem, mitotik ağın arkasındaki düzenleyici mekanizma ve hücre döngüsü saatinin dinamik özellikleri ve işlevleri gibi sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, her birinde birden fazla hücre döngüsü olan büyük miktarda damlacık üreterek bize nicel manipülasyon ve analiz için yüksek işlem çerçevesi sağlamasıdır. Başlamak için, hayvan ve bitkisel direkler veya hayvan direkleri üstüne düzensiz beyaz noktalar arasında belirsiz sınırları olan yumurta toplu atın.
Daha sonra, bir dişi kurbağa dan uygun bir yumurta toplu seçin ve 600 mililitrelik bir kabına yumurta aktarın. 0,2x MMR tampon fazla dökün ve yavaşça yumurta 1x özü tampon sistein ekleyin. Bundan sonra, yumurta jöle kat kaldırmak için elle şiddetle beher sallayın.
Bu yıkamayı toplam 800 mililitre sistein tamponuyla veya yumurtalar toplayıp kabın dibine yerleşene kadar üç kez tekrarlayın. Jöle kat çıkarıldıktan sonra, 0.2x MMR çözeltisi bir litre yumurta dört kez yıkayın. Almak ve beyaz açmak yumurta atmak için bir cam pipet kullanın.
Kabın içinden MMR tamponu dökün ve yumurtaların içine 200 mililitre kalsiyum iyonofon çözeltisi ekleyin. Onlar aktive olana kadar yavaşça yumurta karıştırın ve kalsiyum iyonofçözeltisi solüsyonu kaldırmak için bir cam pipet kullanın. Çok uzun süre kalsiyum iyonofor çözeltisi yumurta bırakarak apoptoz başlatacaktır.
Yumurtaları 1,5 dakika karıştırıyoruz ve aktivasyon verimliliğini kontrol ediyoruz. Etkinleştirilmedikleri takdirde karıştırmaya devam edin ve %90 etkinleştirme elde edilene kadar daha sık kontrol edin. Yumurtalar kabın dibine yerleştikten sonra aktivasyon verimliliğini kontrol edin.
İyi aktive edilmiş yumurtalar hayvan direğinin yaklaşık %25'ine ve bitkisel direğin %75'ine sahiptir. Daha sonra, proteaz inhibitörleri ile desteklenen ekstresi tampon toplam hacmi ile iki kez yumurta yıkayın. Daha sonra yumurtaları dikkatlice 0.4 mililitrelik bir mikrotüpe aktarın.
200 g 60 saniye ve sonra 600 g 30 saniye yumurta paketi için mikrotüp santrifüj. Daha sonra, her adımdan sonra yumurta üstüne fazla tampon kaldırmak için bir cam Pasteur pipet kullanın. Bundan sonra, 15,000 g dört santigrat derece 10 dakika yumurta ezmek.
Ezilmiş yumurta üç kat ayırmak ve orta tabakada ham sitoplazma tutmak için tüpleri kesmek için bir jilet kullanın. Sonra, ultracentrifuge tüpleri temizlemek için ham sitoplazma aktarın. Her mililitre başına 10 mikrogram proteaz inhibitörleri ve sitokasin B ile sitoplazma tamam.
Ham sitoplazmayı 15, 000 g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Sonra, tüp kesmek ve orta tabakada sitoplazma tutmak için bir jilet kullanın. Buz üzerine taze hazırlanmış özler yerleştirin.
Öncelikle hazırlanan ekstrelere securin-mCherry mRNA ekleyin. Daha sonra, ekstrakt mRNA karışımına %2 PFPE-PEG florosüraktif 200 mikrolitre ekleyin. Damlacıklar oluşturmak için bir girdap karıştırıcı kullanın, girdap hızını ve süresini gerektiği gibi ayarlayarak.
Daha sonra, damlacıkları görsel olarak inceleyerek boyutlarının düzgün olduğundan emin olun. 200 mikrolitrelik pipet kullanarak, üstte yüzen damlacıkları ve eşit hacimli yüzey aktif maddeyi PCR tüpüne aktarın. Damlacık tabakasıiçine cam bir tüp batırın ve damlacıkları tüpün yaklaşık% 75 doldurun kadar bekleyin.
Sonra, yüzey aktif tabaka içine tüp itin ve tüp tamamen doldurun. Sonra, mineral yağ ile cam dipli çanak doldurun. Daha sonra, damlacık dolu tüpü yağa batırmak için ince cımbız kullanın.
Görünür enkaz veya sızdırılmış damlacıkları kaldırmak için cam bir pipet kullanın. Damlacıkların hareket etmesini ve sızmasını önlemek için damlacıklarla dolu cam tüp mineral yağın altına dikkatlice daldırılmalıdır. Biz ya denge ile her iki ucunda tüp itebilir ya da aynı anda ilk tüpün uçlarında mineral yağ birkaç damla ekleyebilirsiniz.
Bundan sonra, damlacıkları görüntülemek için motorlu xy aşaması ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanın. Damlacıklar aktivitelerini kaybedene kadar her altı ila dokuz dakikada bir parlak alanda ve birden fazla floresan kanalında hızlandırılmış videolar kaydedin. Bu protokol kullanılarak hem basit, hem nükleer içermeyen hücrelerde hem de çekirdekli komplike hücrelerde mitotik salınım üretildi.
Çekirdeksiz damlacıklar 92 saat boyunca 30'a kadar mitotik salınım yarattı. Mitotik osilatörün mitotik olayları aşağı doğru sürme yeteneği de incelendi. Kendi kendini idame ettiren mitotik osilatör, farklı hücre döngüsü evrelerinin otonom değişimi ile gözlenen nükleer morfolojideğişikliklerine yol açmaktadır.
Bu prosedürü çalışırken, zaman ayarı yaparken zaman akla almak önemlidir, zamana duyarlı olduğu gibi, ve her zaman yumurta tutmak ve buz üzerinde ayıklamak. Bu teknik, geliştirildikten sonra, sistem biyolojisi alanında araştırmacıların Xenopus laevis'te alabilme ve stochastisite gibi karmaşık saat özelliklerinin temel ilkelerini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
