1. X tropicalis Yumurta Üretimi Tüm Xenopus tropicalis kurbağa NASCO gelen sıralanmıştır. Bizim kurbağa devir daim su sistemi 27 tutulur bir Sucul Habitatlar yerleştirilmiştir ° C X&#39;in bakımı için su sistemleri için birçok seçenek vardır tropicalis. Bu kurbağa türü ile ilgili bazı iyi genel bilgiler (Harland ve Grainger laboratuarlarının web sitelerinde bulunabilir <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/" target="_blank">http://tropicalis.berkeley.edu/home/</a> , <a href="http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis/" target="_blank">http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /</a> .) Bizim kurbağa (0.4 gr Ciclid Lake tuzları, 0.6 g deniz tuzu, su, pH 7.0 litresi başına 0.625 g NaHCO3), 20 oluşan tankwater tutulur. X için bir yüksek tuzluluk olan ~ 1.800 ms bir iletkenlik, bu tarifi sonuçları tropicalis. Ancak, bizim kurbağa thi gelişirler bulduks çevre ve oosit kalitesi artırıldı. Alternatif tankwater tarifleri genel X için listelenen kaynaklara üzerinde bulunabilir tropicalis bakım. <ol><li> Kurbağalar döşeme yumurta uyarmak için üç ardışık günlerde insan koryonik gonadotropin (hCG) ile enjekte edilir: Birincisi, hCG çözümün iki konsantrasyonları hazırlamak. 1000 U / ml &#39;lik bir son konsantrasyon için 10 mL steril deiyonize H2O içinde liyofilize hCG tozun yeniden süspanse 10.000 U. Daha sonra, 100 U / ml &#39;lik son bir konsantrasyon için 9 mL H2O içinde 1.000 U / ml hCG çözeltisi 1 ml seyreltin. 4 ° C&#39;de hem de çözümler Mağaza </li><li> 1. günde, 2:00-15:00 arasında hCG ile enjekte edilerek döşeme yumurta için 4-6 kurbağa hazırlar. 0.2 mi, 100 U / ml hCG çözeltisi ile lağım yakın dorsal lenf kesenin her kurbağa enjekte edilir. Sonraki iki enjeksiyon sırasında kurbağa hızlı olan yumurtlama sırasında kurbağa atık mevcut miktarını en aza indirmek, ancak isteğe bağlıdır olacaktır. </li><li> Günde 2, aynı kurbağa enjekte2:00-3:00 arasında 0,2 mi, 100 U / ml hCG çözeltisi eklenmiştir. </li><li> 3. günde, AM 7:00-10:00 arasında, 0.2 ml 1000 U / ml hCG çözümü ile aynı kurbağa enjekte. Taze tankwater ile 6-litre plastik kova doldurmak, 25 karanlıkta kurbağa ve yer ekle ° C: yumurtalarını bırakmak için kurbağa kurmak Bu enjeksiyon sonra, yumurtlama 4 saat sonra başlayacak ve 7 saat ile tamamlanmış olacaktır. Kurbağalar 25 en az tutulur bir ortamda yumurta ° C yatıyordu gerekir </li><li> Çözüm özü ve yumurta toplama hemen önce hazır donanıma sahip olun. </li></ol> 20X MMR: 100 mM HEPES, pH 7.8, 2 mM EDTA, pH 7.8, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl2. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza. Hazırlık ayıklamak hemen önce 1X MMR 1 L hazırlayın. 10X XB: 100 mM HEPES, pH 7,7, 10 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 M KCI, 500 mM sükroz. 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza 1X XB J &#39;nin 1 L hazırlanmasıhazırlık ayıklamak önce ust. Dejelly çözeltisi: 10 N NaOH ile 7.8-8.0 &#39;ye kadar deiyonize H2O ve pH değeri de 250 ml% 3 sistein çözeltisi hazırlayın. Hazırlık ayıklamak hemen önce hazırlayın. CSF-XB: 1X XB 200 ml almak ve 2 ml 0.5 M EGTA pH 7.7 ve 200 ul 1 M MgCl2 ekleyin. Hazırlık ayıklamak hemen önce hazırlayın. BOS-XB +: BOS-XB 50 ml almak ve LPC 50 ul (10 mg / ml her Leupeptin, Pepstatin stok ve DMSO içinde kimostatin) ekleyin. Sitokalasin B 50 ul (DMSO içinde 10 mg / ml) ilave edilir. Hazırlık ayıklamak hemen önce hazırlayın. Sterilize çözülür ve filtre deiyonize H 2 O, mikrodalga% 0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Rezerv 2 Beckman 2 x ½ inç Ultrasantrifüj tüpler. Minder her H 2 O 0.5 ml ile iki 15 ml cam yuvarlak dipli santrifüj tüplerine hazırlayıntüp ultrasantrifüjdeki. Yangın parlatılmış cam Pasteur pipetler olun. Geniş bir açılış ortaya çıkarmak için 5 ¾ inç cam pipetler sonunda koparmak, ve yeni ortaya pipet düzeltmek için alev maruz. <ol start="6"><li> Kat beher duvarlarına yaklaşık% 0.2 jelatin solüsyonu dönen tarafından yumurta depolanması için bir 500 ml&#39;lik bir cam kabın hazırlayın. Kullanımdan sonra kaptan jelatin çözüm atın. </li><li> 3. günde üçüncü enjeksiyondan sonra 6-7 saat döşeme için kullanılan plastik kova yumurta toplayın. İsterseniz, yavaşça kalan yumurta almak için bir kez her kurbağa sıkın. Taze tankwater ve% 0.2 jelatin çözeltisi ile kaplanmış 500 ml&#39;lik bir cam kabın transferi ile bir kez yumurta yıkayın. </li></ol> 2. X ayıklayın hazırlanması tropicalis Yumurta Ekstresi preparatı her adım, yaklaşık 25 ° C&#39;de, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir Yıkama boyunca, yumurta tutmak için önemlidironlar ıslak kalır, böylece s sıvı altında kalmış. Havaya maruz kalma yumurta hücre döngüsü tutuklama kaçmak veya lyse neden olabilir. <ol><li> Yumurta ıslak tutmak için yeterli sıvı saklı tutarak mümkün olduğu kadar tankwater olarak Durusu. Yan yumurta içeren beher yatırın ve beher duvarına doğru ilerler ve ~ 300 mL 1X MMR eklemek, yumurtaların böylece fiziksel ajitasyon en aza indirilir. Süpernatant içeren enkaz kapalı sonra süzün, yumurta dinlendiriniz. X tropicalis yumurta bu adımda lifli, böylece aktive yumurta çıkarılması dejellying sonra yapılır. Üç 1X MMR yıkar toplam tekrarlayın. </li><li> Dejelly yumurta. Dejelly çözüm mümkün ve eklemek yarısı kadar MMR olarak kapalı süzün. Yaklaşık 5 dakika boyunca sürekli olarak girdap. Jöle kat çözme birkaç dakika sonra süpernatant görünür olacaktır. Kapalı Durusu ve kalan dejelly çözüm ekleyin. Yumurta çok sıkı paketi sürekli kadar girdap devam ve bitkisel kutup (tüm orient kutupbeyaz pigment ile) çanak altına doğru. Hızla mümkün olduğu kadar çok dejelly çözüm olarak kapalı süzün. Yumurta dejellied Bir kez onlar mekanik manipülasyonlar çok duyarlıdır. </li><li> Dikkatlice yumurta XB ekleyin. İlk XB yıkama, parçalanmış, kabarık, beyaz ve pseudocleavage yumurta kaldırarak BOS tutuklama kaçmış yumurta çıkarın. Aktif X tropicalis yumurta üst orta yerleşmek eğilimindedir, bu nedenle bu çekin için plastik bir transfer pipet kullanın. Ayrıca deri ve kurbağa atık parçaları çıkarın. Nazikçe yıkar arasında yumurta dönen ve beher altına yerleşmek için izin, ~ 300 ml 1X XB solüsyonu ile yumurta üç kez toplam yıkayın. Mümkün olduğu kadar her bir yıkama çözeltisi yumurta ıslak tutarak daha önce olduğu gibi, süzün. </li><li> CSF-XB ve süzün ile iki kez yumurta yıkayın. </li><li> BOS-XB Ekle + yumurta. E maruz özen, bir jelatin ile tedavi edilen yangın cilalı Pasteur pipeti, BOS-XB + ile transferi yumurta Ultra santrifüj tüplerine kullanılmasıhavaya ggs. Su tamponu ile 15 ml bir cam santrifüj tüpleri içine yerleştirin. </li><li> 1 dakika boyunca 200 xg&#39;de bir klinik santrifüj yumurta Spin, 30 saniye boyunca 800 x g ve spin hızını artırır. </li><li> Yumurta mümkün olduğu kadar tampon kaldırmak için bir aspiratör kullanın. Onlar en neredeyse kuru olmalıdır. Hızlı bir şekilde HB-6 rotor (veya eşdeğeri) ile donatılmış bir Sorvall RC-6 santrifüj yumurta taşıma ve 20 ° C&#39;de 15 dakika 17,000 x g&#39;de dönmeye ° C </li><li> Bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 18 gauge iğne kullanılarak pigment ve lipid tabakaları arasında sarı sitoplazmik katmanı kaldırın. Delinme borunun yan ve yavaş yavaş sitoplazmik özü tabakasını elde etmek için bir şırınga çekin. Pigment granülleri mümkün olduğu kadar önlemek. </li><li> Yeni Ultrasantrifügasyon tüp sitoplazma aktarın. Özü bu adımda biraz bulutlu görünmesi normaldir. 15 ml cam santrifüj tüpüne su yastığı ile içinde yer. 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca tekrar 17,000 x g&#39;de çevirin Ext tekrarlayın18 gauge iğne ile raction. </li><li> 1.5 ml mikrofüj tüpe sitoplazma aktarın. Özü hacmi tahmin ve özü içine Cytochalasin D ve LPC 1:1,000 sulandırmak. , 1 ml pipet ile iyice karıştırın hava kabarcıkları giriş olmadan birçok kez aşağı yukarı pipetleme ve. Sağlıklı bir kurbağa koloniden tipik bir verim özü / kurbağa yaklaşık 300-500 ul. Maksimum etkinlik korumak için, bu muhafaza edilir ve oda sıcaklığında deneysel manipülasyon (20-25 ° C) için gereklidir. </li></ol> 3. X arınma Taxol-stabilize Mikrotübüller tropicalis Özü <ol><li> 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda ekstresi 100-200 ul kısım için Taxol ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kontrol reaksiyonları için, mikrotübül destablilzing ilaç Nokodazol (10 uM) ile özü, eşdeğer hacimde tedavi. Analizi için işlem görmemiş ekstrenin rezervasyon 100 ul. </li><li> Ilaç ile muamele edilmiş seyreltilir10 hacim BRB-80 (80 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) +% 30 gliserol ile çıkarınız. BRB-80 +% 60 gliserol yastık 10 ml içeren 14 ml yuvarlak alt polipropilen borular monte edin. Geniş çaplı bir pipet, katman BRB-80 üstüne hafifçe ilaç ile muamele edilmiş ekstrakt Reaksiyon +% 60 gliserol tampon kullanarak. 20 17.000 x g&#39;de 10 dakika santrifüj ° HB-6 rotor (veya eşdeğeri) ve tüp adaptörleri ile donatılmış bir Sorvall RC-6 santrifüj C. </li><li> Içeren süpernatan unsedimented özü madde aspire edin ve deiyonize H 2 O. ile iki kere yıkayın arayüz Mikrotübül, mikrotübül ilişkili protein ve Taxol ile tedavi edilen örnek mikrotübül ilişkili RNA&#39;lar içeren jel benzeri pelet rahatsız etmemek için özen, yavaş yavaş kalan yastık hacmi aspire. Nokodazol-işlemden geçirilen numune görebilir madde içermez. 1 ml TRIzol içinde pelletini tekrar ve RNA izole etmek için üreticinin talimatlarına devam edin. Untreated ekstresi (100 ml), 1 ml TRIzol doğrudan yeniden süspanse edilebilir. </li><li> RNA-seq uygun transcriptome kütüphaneler hazırlanması için ticari kitleri şimdi var. Bu satın alınabilir <a href="http://www.illumina.com/" target="_blank">http://www.illumina.com/</a> ve <a href="http://www.454.com/" target="_blank">http://www.454.com/</a> . </li></ol>

<ol>
	<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+localization:+gene+expression+in+the+spatial+dimension.">mRNA localization: gene expression in the spatial dimension.</a> Cell. 136, 719-730 (2009).</li><li>Besse, F., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+localized+mRNAs:+restricting+protein+synthesis+in+space+and+time.">Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 971-980 (2008).</li><li>Lawrence, J. B., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+localization+of+messenger+RNAs+for+cytoskeletal+proteins.">Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins.</a> Cell. 45, 407-415 (1986).</li><li>Mingle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+all+seven+messenger+RNAs+for+the+actin-polymerization+nucleator+Arp2/3+complex+in+the+protrusions+of+fibroblasts.">Localization of all seven messenger RNAs for the actin-polymerization nucleator Arp2/3 complex in the protrusions of fibroblasts.</a> J. Cell Sci. 118, 2425-2433 (2005).</li><li>Blower, M. D., Feric, E., Weis, K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+demonstrates+conserved+localization+of+messenger+RNAs+to+mitotic+microtubules.">Genome-wide analysis demonstrates conserved localization of messenger RNAs to mitotic microtubules.</a> J. Cell Biol. 179, 1365-1373 (2007).</li><li>Eliscovich, C., Peset, I., Vernos, I., Mendez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle-localized+CPE-mediated+translation+controls+meiotic+chromosome+segregation.">Spindle-localized CPE-mediated translation controls meiotic chromosome segregation.</a> Nat. Cell Biol. 10, 858-865 (2008).</li><li>Sharp, J. A., Plant, J. J., Ohsumi, T. K., Borowsky, M., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+microtubule-interacting+transcriptome.">Functional analysis of the microtubule-interacting transcriptome.</a> Mol. Biol Cell. 22, 4312-4323 (2011).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Mili, S., Moissoglu, K., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+reveals+APC-associated+RNAs+enriched+in+cell+protrusions.">Genome-wide screen reveals APC-associated RNAs enriched in cell protrusions.</a> Nature. 453, 115-119 (2008).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters.">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Desai, A., Murray, A., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro.">The use of Xenopus egg extracts to study mitotic spindle assembly and function in vitro.</a> Methods Cell Biol. 61, 385-412 (1999).</li><li>Gache, V., Waridel, P., Luche, S., Shevchenko, A., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+mass+spectrometry+identification+of+microtubule-binding+proteins+from+Xenopus+egg+extracts.">Purification and mass spectrometry identification of microtubule-binding proteins from Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol. Med. 137, 29-43 (2007).</li><li>Gache, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+meiotic+microtubule-associated+interactome.">Xenopus meiotic microtubule-associated interactome.</a> PLoS One. 5, e9248 (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li><li>Cross, M., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+nuclear+assembly+using+fractionated+Xenopus+egg+extracts.">In vitro nuclear assembly using fractionated Xenopus egg extracts.</a> J. Vis. Exp. (19), e908 (2008).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Hellsten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328, 633-636 (2010).</li><li>Brown, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Godfrey, E. W., Sanders, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+water+hardness+on+oocyte+quality+and+embryo+development+in+the+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Effect of water hardness on oocyte quality and embryo development in the African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp. Med. 54, 170-175 (2004).</li><li>Groisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB,+maskin,+and+cyclin+B1+mRNA+at+the+mitotic+apparatus:+implications+for+local+translational+control+of+cell+division.">CPEB, maskin, and cyclin B1 mRNA at the mitotic apparatus: implications for local translational control of cell division.</a> Cell. 103, 435-447 (2000).</li><li>Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+polymerization+in+vitro+and+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 38, 29-34 (2006).</li><li>Kalab, P., Pu, R. T., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ran+GTPase+regulates+mitotic+spindle+assembly.">The ran GTPase regulates mitotic spindle assembly.</a> Curr. Biol. 9, 481-484 (1999).</li><li>Gaglio, T., Saredi, A., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuMA+is+required+for+the+organization+of+microtubules+into+aster-like+mitotic+arrays.">NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays.</a> J. Cell Biol. 131, 693-708 (1995).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtubule+interactome:+complexes+with+roles+in+cell+cycle+and+mitosis.">A microtubule interactome: complexes with roles in cell cycle and mitosis.</a> PLoS Biol. 6, e98 (2008).</li><li>Suprenant, K. A., Tempero, L. B., Hammer, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+ribosomes+with+in+vitro+assembled+microtubules.">Association of ribosomes with in vitro assembled microtubules.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 14, 401-415 (1002).</li><li>Rebagliati, M. R., Weeks, D. L., Harvey, R. P., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+localized+maternal+RNAs+from+Xenopus+eggs.">Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs.</a> Cell. 42, 769-777 (1985).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda X BOS-tutuklandı yumurta özleri üretmek için basit bir yöntem tarif var tropicalis 19 ve mikrotübül ilişkili RNA&#39;lar 7 incelemek için bu özü kullanın. X den BOS-tutuklandı yumurta özler üretmek için temel prosedür X için kullanılan tropicalis aynıdır birkaç önemli farklılıklar ile laevis. X ile çalışan en zor yönlerinden biri tropicalis kurbağa X karşılaştırılabilir mikrotübül çekirdeklenme veya milli montaj aktivite ile bir özü için yeterli kaliteli yumurta elde edilir laevis yumurta ayıklar. Mayoz II hücre döngüsü tutuklama, X için hormon enjeksiyonları arasındaki aralıktan kayma önlerken en uygun yumurtlama koşulları elde etmek için tropicalis X için kullanılan daha kısadır laevis ve yumurtlama başına üçüncü hCG enjeksiyonundan zamanlama da çok kısadır. X ile hCG enjeksiyonundan t zamanlama laeviso yumurtlama başında bu tampon içine bir gecede döşenecek yumurta için uygun ve etkili olduğu gibi. Ancak, hCG enjeksiyonu ve yumurta arasındaki kısa zaman X ile döşeme sık sık el kurbağalar yumurta ifade için gerekli olan tropicalis. Iki farklı kurbağalar yumurta özü yapma arasındaki bir diğer önemli fark dejellying adımdır. X ile yumurta laevis bu jöle kat yumurta beher ne kadar yakın yerleştirileceğini gözlemleyerek çözünmüş ne zaman belirlemek kolaydır o kadar büyüktür. Dejellying reaksiyon başlangıcında, yumurta daha yoğun paketi başlar. Ancak, X. tropicalis yumurta çok daha küçük ve jöle kat tek başına yoğunluğu ambalaj yumurta tarafından çözülür ne zaman belirlemek için oldukça zor olabilir. Biz, jöle kat çözündürüldü ne zaman tamamlandığını belirlemek için en güvenilir yöntem hayvan (siyah) ve bitkisel (beyaz) kutup yönü izleme olduğunu bulduk. Ne zaman tüm bitkisel kutup oribeher altına doğru ent jöle kat ekstresi ile devam etmek için yeterli kaldırıldı. Son olarak, oysa X laevis yumurta özü serin sıcaklıklarda saklanabilir (4-12 ° C) bunu X korumak için kritik olduğunu gözlemledik hazırlanması ve deneysel manipülasyonlar sırasında oda sıcaklığında tropicalis yumurta özü (20-25 ° C) biyokimyasal faaliyet korumak için. Çünkü kullanım kolaylığı farklılıklar biz X kullanmayı tercih Yumurta özü üretimi için laevis kurbağa. Ancak, ihtiyaç ya da sıralı genom, X ile bir organizma tarafından kolaylaştırdı deneyler için tropicalis mükemmel bir alternatif sistemidir. Bu raporda açıklanan olduğunu yöntemi mikrotübül polimerizasyon ikna etmek için bir mikrotübül-dengeleyici ajan olarak taksol kullanır. Taksol mikrotübül saflaştırılmış büyük ölçekli izolasyon kolaylaştıran sağlam bir mikrotübül stabilize edici, çünkü bu yöntem seçtik. Gibi bir yöntem incibiz tarif de olası alternatif mikrotübül polimerizasyon yöntemleri kullanılarak mikrotübül ilişkili protein ve RNA karşılaştırarak geliştirilebilir. Alternatifler GTP bağlı polimerizasyon (klasik bir teknik), 22 veya kromatin odaklı mili montaj 23 neden olduğu mikrotübül taklit etmek için bir mikrotübül polimerizer olarak Ran-GTP kullanarak kullanarak polimerizasyon içerebilir. Son olarak, mikrotübül polimerizasyon en yakın mitoz (centrosome, kromatin ve kinetochore aracılı) sırasında çekirdeğini olan mikrotübül türlerine taklit olacağını ikna etmek için sperm çekirdekleri saflaştırılmış kullanın. Mikrotübül çekirdeklenme bu alternatif kaynaklara dezavantajları çekirdekleştirici ajanlar taksol kadar hazır değildir ve onlar çekirdekli yok ya da verimli Taksol olarak mikrotübül stabilize. Bu nedenle, bu yöntemlerin her büyük ölçekli saflaştırılması için kullanmak daha zor olacaktır. Mikrotübül Nükleatörler birden fazla farklı türde karşılaştırma avantajıbu protein ve / veya mikrotübül çekirdeklenme her yolu özgü RNA&#39;lar belirlemek mümkün olabilir olmasıdır. Burada anlattığımız yöntem, amfibi sitoplazmik özleri yararlanır. Ancak, bu yaklaşım diğer organizmalardan özü sisteminin kullanımı için uzun olabilir. Mitotik özleri sadakatle mikrotübül montaj birçok açıdan özetlemek bu senkronize insan doku kültürü hücreleri 24 tanımlanmıştır. Başarıyla HeLa hücreleri 5&#39;ten mikrotübüle bağlı RNA&#39;lar tanımlamak için bu ekstreler kullandık. Mikrotübül ilişkili RNA&#39;lar incelenmiş değil de benzer mikrotübül arıtma planları, birçok farklı organizmalar 25,26 için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yaklaşım, mikrotübül çekirdekleştirici yeteneğine sahip bir konsantre sitoplazmik özü üretebilen herhangi bir organizma ile kullanılabilir. Son olarak, her ne kadar bu biz de yaklaşımBurada yazıcı mikrotübül ve ilişkili protein ve RNA&#39;lar arıtma tartışır, bu yaklaşım diğer hücre içi yapılara genel olabilir. En lokalize mRNA biyokimyasal yöntemlerle tespit edilmemiş olsa da DNA ve RNA dizi teknolojilerindeki son gelişmeler bu yaklaşımın yerel RNA&#39;lar tanımlamak için cazip bir yöntem yapmak. Bu yaklaşımda ilgi herhangi bir hücre içi veya alt embriyo yapısı izole veya saf olabilir. Daha sonra ilgili protein ve RNA bir genom geniş ölçekte tespit edilebilir. RNA&#39;lar sonra, toplam hücre ya da zenginleştirilmiş lokalize RNA&#39;lar tespit etmek embriyo RNA içeriği ile karşılaştırılabilir. Bu yaklaşım, bütün olarak (27, Xenopus birinci lokalize RNA&#39;lar tespit yaklaşım benzer hayvansal ve bitkisel ayırma), yumurta, aktin ilişkili RNA&#39;lar ER-ilişkili RNA&#39;lar mitokondri ilişkili RNA&#39;lar ile ya da herhangi bir olabilir hücre içi yapısı için kullanılabilir bozulmamış ilişkili RNA&#39;lar ile daha da saflaştırılabilir. Göremikrotübül ilişkili RNA üzerinde çalışmalarımızı bu belirli bir yerde yeni bir protein bu işlevi keşfetmek için mükemmel bir yöntem olacağını tahmin. Ayrıca, tüm yerelleştirilmiş RNA&#39;lar yerini ve kapsamı belirlenmesi hücreleri ve embriyoların gen ekspresyon kontrol etmek için mRNA lokalizasyon kullanarak nasıl içine fikir verecektir.

Gen ifadesinin mekansal ve zamansal kontrolünün tüm hücreler için önemlidir ve 1 dizilmesine erken evredeki embriyonik bölgesinin kontrolü için özellikle önemlidir. Gen ifadesinin mekansal kontrol hücreleri ya da embriyolar içinde belirli bir noktaya mRNA&#39;ların aktif lokalizasyonu ile elde edilir. Çok sayıda çok büyük hücre tipleri (örneğin, oositler, embriyolar ve nöronlar) mRNA lokalizasyonu kodlanmış protein eylem sözlük protein ekspresyonu sınırlamak için kullanılır. Yerelleştirilmiş bir mRNA protein üretimi birçok tur katalize çünkü bireysel protein molekülleri tespit etmek için daha bir mRNA tespit etmek için daha etkilidir. Onlar daha kodlu protein 2 lokalizasyonu neden olmaktadır hedeflerine, ulaşana kadar lokalize mRNA genellikle translationally baskı vardır. Embriyonik desenlendirme kontrol etmek için RNA lokalizasyonu çok iyi belgelenmiş durumda ek olarak, çeşitli çalışmalar lokalize mRNA belgeledikodlanmış protein eylem sitesine. Tanınmış örnekler hareketli fibroblast öncü için β-aktin 3 ve Arp2 / 3 4 mRNA lokalizasyonu ve mayoz ve mitoz iğ 5-7 birçok mitoz düzenleyiciler için mRNA lokalizasyonu içerir. Lokalize mRNA&#39;ların klasik örneklerin çoğu anne etkisi mutasyonlar için genetik ekranlarında belirlendi ve daha sonra lokalize RNA&#39;lar kodlamak için belirlenmiştir. Ancak, son genom çalışmaları lokalize RNA&#39;lar kapsamına geniş bilgi sağlar başladı. Drosophila embriyolar in situ hibridizasyon ekranında yeni bir tüm mRNA&#39;ların ~ 70% birçok yeni destinasyonlarda 8 dahil olmak üzere belirli bir yeri, sahip olduğunu göstermiştir. Fare fibroblastlardan pseudopodia saflaştırılması lokalize mRNA 9 çeşitli bir grup belirledi. Mayoz Xeno gelen mikrotübül biyokimyasal arıtma kullanarak gruptan çalışmairin yumurta mil 5,7 ile copurify mRNA&#39;ların tespit yüzlerce ayıklar. Çalışmalarımız mRNA&#39;lar, kodlanmış protein eylem sitesine lokalize olduğu fikrini desteklemektedir, mikrotübül-lokalize mRNA&#39;ların çoğunluğu mitoz kontrol işlevi proteinleri kodlayan gösterdi. Ayrıca, biyokimyasal arıtma tarafından bir hücre içi kısmını mRNA zenginleştirme tespit yeteneği lokalize mRNA belirlenmesi için bu yaklaşımın gücünü vurgulamaktadır. En lokalize RNA&#39;lar nihai hedef 10 ulaşım ulaşmak için, aktin veya mikrotübül ya, hücre iskeleti aktif taşıma kullanın. Bu iskelet işlemleri özetlemek olduğunu in vitro sistemde bir olması için gerekli olan biyokimyasal bir yaklaşım kullanarak belirli hedeflere lokalize RNA&#39;lar ölçüde ve türleri daha iyi anlamak için. Sitoskeletal biyoloji eğitimi için önde gelen sistemlerinden biri üretilen yumurta özleri olankurbağa Xenopus laevis. X den döllenmemiş yumurta laevis yumurta özleri iskelet süreçleri geniş bir dizi çalışma için yıllardır kullanılmaktadır ve iskelet montaj ve dinamikleri 11 kontrol mekanizmaları ve moleküllerin anlayışımızı çok katkıda bulunmuştur. Ayrıca, X. laevis yumurta özü ve mikrotübüllerin 12,13 ilişkili proteinlerin büyük ölçekli saflaştırılması için uygun olan ve yumurta özü 14-16 çeşitli üretimi için iyi tasarlanmış bir yöntem vardır. Bununla birlikte, genomik çalışmaları için X&#39;in kullanımı için çeşitli dezavantajları vardır bir model sistem olarak laevis. On yıllardır Xenopus laevis kurbağa büyük oosit büyüklüğü ve sağlam dış gelişme 17 nedeniyle gelişim ve hücre biyolojisi, çalışma için güçlü bir sistem olmuştur. Ayrıca, birçok hücresel processe özetlemek olabilir yumurta özü sistemlerinin geliştirilmesibir test tüpünde s bu kurbağa güçlü bir deneysel model yaptı. Ancak, Xenopus laevis genome.In kontrast allotetraploid doğanın yavaşladı olan bir tam genom dizisi, eksikliği engel olmuştur, bir yakından ilişkili türler, Xenopus tropicalis 2010 18 sıralı bir diploid genom vardır. Iken X tropicalis X gibi deneysel olarak izlenebilir değildir laevis 17 bir sıralı genomunun kullanılabilirliği genom geniş analizleri yapmak için çekici bir model sistem yapar. Bu yazıda X den mayoz II-, sitostatik faktör-tutuklandı özler (BOS) yapmak için bir yöntem tarif tropicalis 19. Biz o zaman bu özü mikrotübüllerin ve ilgili RNA&#39;lar arındırmak için basit bir yöntem tarif. RNA&#39;lar sonra yeni geliştirilmiş yüksek verimlilik sıralaması teknolojileri kullanarak sıralama için uygun kütüphaneler dönüştürülebilir. Kütüphaneler kezbunlar toplam özü göre mikrotübül örnek zenginleşmiş spesifik mRNA tespit etmek kurbağa genomuna hizalanabilir sıralanır. Bu bir genom ölçekte mikrotübül hedefli mRNA lokalizasyon tespit etmek için güçlü bir yöntem sağlar. Lokalize mRNA tespit edebilmek olmasının yanı sıra, yüksek verimli sıralama ve sıralı genomunun kullanımı kamu veritabanı açıklamalar şu anda mevcut olmayan yeni transkript keşfetme imkanı sunuyoruz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus tropicalis </td>
			<td>NASCO</td>
			<td>LM00823MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, free base</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>14030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cichlid Lake Salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>47894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>SC7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid Plastic bucket</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Polyallomer 2 x &frac12; inch Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45500-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>45550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &frac34; inch glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall HB-6 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of xenopus tropicalis egg extracts to identify microtubule-associated rnas

Birçok organizma mekansal ve zamansal kontrolü gen özgü hücre içi hedeflere mRNA lokalize. Son çalışmalar transcriptome çoğunluğu hücreleri ve embriyolarda bir tesadüfi olmayan konuma lokalize olduğunu göstermiştir. Lokalize mRNA belirlemek için bir yaklaşım biyokimyasal ilgi bir hücresel yapı arındırmak için ve tüm ilişkili transkript belirlemektir. Yakın zamanda geliştirilen yüksek verimli sıralama teknolojilerini kullanarak artık bir hücre içi yapı ile ilgili tüm RNA&#39;lar tanımlamak için basittir. Transkriptlerini tanımlamayı kolaylaştırmak için, bir tam sıralı bir organizma genomu ile birlikte çalışmak için gereklidir. Hücre içi yapıların biyokimyasal arıtma için bir çekici sistemi kurbağa Xenopus laevis üretilen yumurta alıntılar vardır. Ancak, X laevis şu anda transkript kimlik engellemektedir tam sıralı genom, yoktur. Bu yazıda bir yöntem tarifilgili kurbağa, X gelen yumurta özler üretmek için Bir tam sıralı bir genomu olan tropicalis. Biz mikrotübül polimerizasyon, arıtma ve transkript izolasyonu için ayrıntıları. Bu makalede mikrotübüle bağlı transkript tanımlanması için özel bir yöntem tarif ederken, bunun kolayca diğer hücre içi yapılarına uygulanabilir ve lokalize RNA&#39;lar belirlenmesi için güçlü bir yöntem sağlar inanıyoruz.

X belirlemek için mikrotübül ilişkili tropicalis transkript, biz mayoz II (BOS) metafaz tutuklandı döllenmemiş yumurta bir sitozolik özü hazırlamak. Taksol ile özü tedavisi gliserol yastık (Şekil 1A) ile çökelme ile daha da arıtılabilir stabil mikrotübül oluşumunu sağlar. Coomassie jel analizi α / β-tubulin bir taksol bağımlı bir şekilde çökeltiler ve ana protein türü temsil etmektedir, bu preparatlar (Şekil 1B) geri kazanılır olduğunu doğrular. Diğer proteinlerin düşük seviyelerini gösteren, ilaç Nokodazol depolimerizasyon mikrotübül ile tedavi hazırlıkları da taksol pelet mevcut, ama bu mikrotübül (MAP) ile özellikle ortak taksol kısmını proteinler. Bir Agilent Bioanalyzer tüm X genel RNA kompozisyon incelemek için kullanılır tropicalis özü fraksiyonları (Şekil 1C </strong&gt;). RRNA ve tRNA türlerinin her iki çeviri X&#39;te mikrotübüllerin ve iğ oluşur daha önceki bulgularla tutarlı, BOS özü ve mikrotübül içeren Taksol pelet mevcuttur laevis yumurta 5,21 ayıklayın. Jel projeksiyon bir çizgi izlemesi mRNA sinyali belirgin düşüktür ortaya mikrotübül içeren gösteren, 28S rRNA üzerindeki bölgede göç en önemlisi taksol pelet, bu X&#39;te mikrotübüllerin ile mRNA cosediment bir alt tropicalis. Bu şekilde izole edilen RNA, ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, RNA-DİZ deneyler için uygundur. <img src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg" /> Şekil 1. RNA-DİZ MT-RNA saflaştırılması. MT-RNA izole etmek için (A), saflaştırma şeması. Yumurta dişi X hasat edilir tropicalis kurbağa. Sitoplazmik bir ekstresinin hazırlanması sonra taksol mikrotübül polimerizasyon ikna etmek için ilave edilir. Mikrotübüller ve MT-RNA, gliserol yastığı sedimantasyon ile saflaştırılır. (A) &#39;de tarif edilen şema kullanılarak izole edilmiş protein (B), Coomassie jel analizi. Toplam CSF taksol veya Nokodazol varlığında çöktürülmüştür proteinleri ile karşılaştırıldığında ekstraktıdır. (C) RNA, Bioanalyzer jel analizi (A) &#39;de tarif edilen şema kullanılarak izole edilmiştir. BOS RNA izole taksol veya Nokodazol varlığında çöktürülmüştür RNA ile karşılaştırıldığında özü. Jel projeksiyon hattı izlerinin her ikisini de gösterilmiştir. Keskin, et al., (2011) izni ile yayımlanmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs at JoVE.com

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Biz döllenmemiş toplanması tarif<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta ve bir mayoz II-tutuklandı yumurta özü üretim. Bu yumurta özü mikrotübüller ve mikrotübül-ilişkili RNA&#39;lar saflaştırmak için kullanılabilir.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

production-xenopus-tropicalis-egg-extracts-to-identify-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

13.6K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Biz döllenmemiş toplanması tarif Xenopus tropicalis Yumurta ve bir mayoz II-tutuklandı yumurta özü üretim. Bu yumurta özü mikrotübüller ve mikrotübül-ilişkili RNA'lar saflaştırmak için kullanılabilir.

Video: Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biyoloji

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

Coregulated Genler Potansiyel Düzenleme Motifler belirlenmesi için KAPSAMI

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta ayıklar

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Kanatlı Üretim Örneklerden Bakteriyel Topluluklar Nitel ve Nicel Değerlendirme Karma DNA Ekstraksiyon Yöntemi

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...