Biz yazının eleştirel okuma için Laurie Lee teşekkür ederiz. TWC bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral Kardeşliği (12PRE6590007) tarafından desteklenmektedir. MRB Ulusal Kanser Enstitüsü eğitim bursu (T32 CA119925) tarafından desteklenmektedir. SSH Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK078640) tarafından desteklenmektedir. EL Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM081635 ve R01GM103926) tarafından desteklenmektedir.

Xenopus Yumurta Özü 1. Hazırlanması NOT: Her kurbağa kullanılabilir yumurta ekstresi, yaklaşık 1 ml verir. 10 kurbağalar ekstreler, tipik olarak bir anda hazırlanır, ve aşağıda tarif tampon hacmi, 10 kurbağa Xenopus yumurta özü hazırlık yapmak için olan edilir. Tampon madde hacmi, yumurta özü daha büyük veya daha küçük preparasyonlar için uygun olarak ayarlanabilir. Bu şekilde üretilen Preps sürekli protein konsantrasyonlarının ≥ 50 mg / ml elde edildi. Iki kişi tarafından gerçekleştirildiği zaman yumurta toplama ve özü içine işleme süreci en verimli. (Temel kurbağa yetiştirme teknikleri için, Sive et al. 33). <ol><li> Yumurta Toplama <ol><li> Prime kurbağalar, bir taze yapılmış 250 U / ml stok Hamile Mare Serum Gonadotropin 100 U (PMSG) ile her bir dişi kurbağa enjekte. Ve konik, deri altından enjekte etmek için bir 27 G iğne ile, 3 ml tüberkülin şırınga kullanınYaklaşık 1 cm uzakta kurbağa bacaklarının uzunluğu boyunca çentikli renklenmeler gelen orta hattan bulunduğu dorsal lenf kesesi içine iğne kadar. </li><li> Su deposu astarlanmış kurbağa 5-10 gün boyunca 18 ° C &#39;de (ek 20 mM NaCl, Sive et al. 33). Su tankı sistemleri ayakta için, hayvan yoğunluk dişi kurbağa başına su yaklaşık 4 L,. NOT: yürürlüğe girmesi emişli için gereken minimum süre 5 gün ve prime etkisi 10 gün sonra eskitmek. </li><li> 20x MMR stoktan 0.5x Marc&#39;ın Modifiye Ringers (MMR) çözeltisi hazırlayın. (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 - 20x MMR 2 M sodyum klorid, 40 mM potasyum klorid, 40 mM kalsiyum klorid, 20 mM magnezyum klorür ve 100 mM 4 oluşur. </li><li> Tüm enjekte kurbağalar (4 L kova başına bir kurbağa) kepçeler ayarlayın. NOT: Birden fazla kurbağa, yumurta toplanması için aynı kova yerleştirilebilir rağmen eğer kurbağa biriağırlıklı olarak kalitesiz yumurta bırakır, çaba önemli bir miktarda ekstresi yapmak için uygun olanlardan kalitesiz yumurtaları ayırmak için gerekli olacaktır. Böylece, yumurta için kullanılan tampon miktarını en aza indirmek için aynı tankta kurbağa sayısını toplamak maksimize risk almaya değmez. </li><li> 1.1.1 de açıklandığı gibi, 27 G iğne kullanılarak her bir kurbağa dorsal lenf kesesi içine 750 U İnsan koryonik gonadotropin (HCG) enjekte edilir. </li><li> 0.5x MMR içeren tek 4 L kova içine HCG enjekte kurbağaların her Sıra 16 ° C&#39;ye soğutuldu </li><li> O / N (15-16 saat) yumurta toplamak için bir 16 ° C inkübatör kurbağa ile kapları yerleştirin. Not: uygun sıcaklık bakımı yumurta ekstrenin hazırlanması için yumurta toplama gelen, bütün prosedür için çok önemlidir. </li></ol></li><li> Yumurta Dejellying NOT: Yumurta öncesi özü yapmak için kaldırılması gereken bir jöle tabakası ile kaplıdır. Yumurta kendiliğinden lizis olasılığı zaman betwee artarn yumurtlama ve hazırlık artar ayıklayın. Bu nedenle, mümkün olduğunca hızla aşağıdaki adımlarda devam etmek önemlidir. <ol><li> 1x MMR 4 L, 0.1x MMR 50 ml ve damıtılmış su içerisinde yapılan% 2 sistein, pH 7.7, 400 ml hazırlayın. 16 ° C&#39;de tüm çözümler koruyun </li><li> Ek yumurta çıkarmak için yavaşça kurbağa alt sırt ve karın sıkın. </li><li> , Kurbağa ve MMR toplu çıkarın her kova MMR yaklaşık 1-200 ml yumurta bırakmak. </li><li> Bir transfer pipet ile enkaz kaldırma ve yumurta kalitesini değerlendirmek: Yüksek kaliteli yumurta genellikle koyu pigmentli hayvan yarımkürede ve hafif renkli bitkisel yarımkürede arasında net bir ayrım tarafından işaretlenir ve en koyu-to-ışık kontrast vardır. Bir transfer pipet atmak onlar ekstraktının genel kalitesini azalacak gibi (beyaz ve kabarık), lifli benekli veya lize görünür herhangi bir yumurta. Yumurtaların&gt;% 10 kalitesiz ise, tümToplu atılmalıdır. </li><li> 500 ml&#39;lik bir cam kabın içine yumurta birleştirin ve su altı yumurta tutarken mümkün olduğunca MMR dökmek. </li><li> MMR iki yumurta hacmi ile nazik dönme tarafından yumurta durulayın. Iki kez tekrarlayın, ve herhangi bir enkaz veya açıkça kalitesiz yumurta kaldırmak. </li><li> , Cam behere 2% sisteinin yaklaşık 100 ml ilave edilir karıştırmak için yavaşça girdap ve yumurta 16 ° C&#39;de 5 dakika boyunca yerleşmek için izin Sistein dökün. NOT: onlar şimdi jöle kat olmadan daha küçük bir hacim işgal olarak Dejellying yumurta ve yumurta daha kompakt ambalaj üzerinde yüzen jöle kat kademeli görünümünü tarafından işaretlenir. </li><li> ,% 2 sisteinin diğer bir 100 ml ilave edilir yavaşça girdap, 5 dakika bekleyin ve daha sonra yavaş yavaş sistein dökün. Yumurta (genellikle üçüncü sistein tedavisi ile) sıkıca sıkıştırılmış haline gelmiştir kadar tekrarlayın. Not: yumurta sistein çok uzun süre kalan, bunlar lize yatkındır. Benzer şekilde, dejellied yumurta kırılgan ve mekanik liziz eğilimli eğerOnlar havaya maruz eğer çok güçlü bir şekilde kıvrıldı veya edilir. Yumurta dejellied edilmiş, hızlı bir şekilde santrifüj adımları devam etmek için önemlidir. </li><li> Sistein dökün ve hafifçe 1x MMR yumurta yıkayarak jöle ceket ve diğer enkaz uzaklıkta yıkayın. Beherin tarafı boyunca dikkatli bir şekilde tampon dökün. Iki kez tekrarlayın veya MMR çözüm kadar bulutlu artık. 1x MMR ile durulama sırasında bir transfer pipet kullanarak kötü yumurta kaldırmak için devam ediyor. </li><li> 30 ml 0.1x MMR ile bir nihai nazik durulama gerçekleştirmek ve yavaşça mümkün olduğu kadar tampon kadar kapalı dökün. Yine, herhangi bir tabii ki kötü yumurta kaldırmak. </li></ol></li><li> Santrifüj ile Yumurta Paketleme ve Kırma Not: Bu, aşağıda tarif Ekstre β-katenin bozulması için kullanılan sitostatik faktör ekstraktı (metafaz II-tutuklandı) bir çeşididir. Hücre döngüsü çalışmaları için kullanılan düşük hızda ve yüksek hızlı ekstresi aksine, orta hızlı ekstresi β-katenin indirgenmesi için en iyi şekilde çalışır. Benhazırlamak için yoğun emek daha olmasına rağmen nterphase özü benzer sağlam β-katenin bozulmasını teşvik etmektedir. <ol><li> 10 mg / ml stok solüsyonundan seyreltilmiştir 20 ug / ml (at ve Cytochalasin D (a DMSO içerisinde 10 mg / ml stok çözeltisinden seyreltilmiş) 10 ug / ml &#39;de Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin karışımı (LPA, bir proteaz inhibitörü) ekleme 0.1x MMR kalan 20 ml), DMSO. </li><li> 0 ekleyin. X MMR yıkandı, yumurta ve LPA Cytochalasin D ihtiva eden, yavaşça girdap ve 16 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe </li><li> , 16 ° C önceden soğutulmuş 50 ml santrifüj tüplerine yumurta transferi yumurta yerleşmek için izin ve üst kalıntı tamponu çıkarın. , Havaya maruz kalmayı önlemek önce transferini yumurta çekilmesi için aktarma pipet içine tampon küçük bir miktar geri çekmek için. Yumurta üstüne santrifüj tüpü doldurmak kadar verimini maksimize edecek olan, santrifüj tüplerine ilave yumurta transferi ve tüpün üstünden kalan tampon kaldırmak için devamayıklayın. </li><li> Bir sabit açılı rotor kullanılarak 4 ° C&#39;de 60 saniye boyunca 400 xg&#39;de yumurta, spin santrifüj tüpleri paketi için. Santrifüj tüplerine üstünden kalıntı tamponunu çıkarın. </li><li> Ezme bir dönüş için, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de tüpler dönmeye </li></ol></li><li> Özü Sitoplazmik Katmanı Toplama Not: Aşağıda tarif edilen yöntem olup, sitoplazmik tabaka toplamak için, santrifüj tüpünün yan delme klasik yöntem farklıdır. Bu protokol, basitleştirme ve yeniden kullanılabilir, özellikle santrifüj tüpleri, kullanım için adapte edilmiştir. Β-katenin degradasyon kinetiği hiçbir gözle görülür bir fark yöntemi ile ya da bulunur. Bu noktada özü de süreç boyunca sırasında soğuk tutulmalıdır ve tüm adımlar 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmelidir <ol><li> P1000 pipet kullanarak lipit tabakasında bir delik temizleyin. </li><li> Koyu renkli bir tabaka ile li arasında sitoplazmik tabakasının (toplamaktemiz önceden soğutulmuş santrifüj tüplerine yeni P1000 pipet kullanarak GHT lipit tabakası) (Şekil 1). Sağlam β-katenin bozan, yüksek kaliteli özü için, sitoplazmik tabaka ile çekilir pigmentli ve lipid tabakasının miktarını en aza indirir. </li><li> Spin 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de sitoplazmik tabaka tekrar ekstre edildi ve sitoplazmik faz toplanır. Spin ve çıkarma 1X tekrarlayın. NOT: özü &quot;saman renkli.&quot; Olmalıdır Önemli bir kirlenme bu noktada pigmentli ve lipid tabakaları ile varsa fazla döndürme β-katenin indirgeme özü kapasitesini azaltmak rağmen, bir, spin bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 10 ug / ml her bir nihai konsantrasyonlarda ekstreye LPA ve Cytochalasin D ekleyin. Not: tanımlanan yöntemi kullanarak, bir yaklaşık olarak 50 mg / ml &#39;lik oldukça tutarlı bir toplam protein konsantrasyonunu (52.41 ± 5.40 mg / ml, n = 3 ayrı preparatlarıyla) Xenopus verir, örneğing özler. </li><li> (İsteğe bağlı) çeviri tahlilleri için, kapaklı mRNA (0.1 mg / ml) ekleyin, RNAsin (1.5 U / ml), ve enerji yenilenmesi karışımı (2.2.1) ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında, reaksiyonu inkübe (Daha fazla bilgi için bkz: Salisli diğ ark. 2 ve Sive et al. 33). Β-katenin bozulması deneyleri ya da daha sonra kullanmak için sıvı azot içinde ek dondurulmasını yerelleştirilmiş özü kullanın. NOT: Taze hazırlanmış özü egzojenik eklendi mRNA çevirmek için yüksek kapasiteye sahip, ama özü donmuş bir kez, ne yazık ki, bu kapasite kaybolur. Kapaklı mRNA hali hazırda ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak hazırlanabilir. </li><li> Sıvı nitrojen içinde dondurularak özü ek bileşen. Not: hızla refrozen ise β-katenin indirgeme kapasitelerini kaybeder çünkü özleri, tek kullanım için küçük (200 ul) alikotlar içinde muhafaza edilirler. Uzun süreli depolama için, özü sıvı azot içinde saklanabilir. Kısa süreli depolama için, özü, -80 ° C&#39;de saklanabilir rağmen kapasite oβ-katenin indirgeme f çıkarmak önemli ölçüde -80 ° C (2 aydan daha uzun) da uzatılmış depolama ile azaltılabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Β-katenin Parçalanma Testi için ekstresinin hazırlanması <ol><li> Xenopus Özü Tükenme Not: Xenopus özü önemli bir avantajı, kolay bir şekilde bir yolunun bileşenlerini tüketmek ve tam da doza bağlı etkileri belirlemek amacıyla bir proteinin belirli bir miktar geri ekleme kapasitesidir. <ol><li> Taze hazırlanmış Xenopus yumurta özü kullanın ya da hızlı buz üzerinde donmuş özü ve yer eritin. Soğuk tüm manipülasyonlar gerçekleştirin. </li><li> Topak haline antikor veya afinite taneleri (örneğin, 200 mi, 20 ml ekstresine topak boncuk) hacminin 1/10 ile özü ekleyin. , Ekstrenin seyreltme en aza indirmek uzun, konik uçları olan jel yükleme ipuçları ile özü eklenerek önce mümkün olduğu tanelerden kadar sıvıyı çekmek için. </li><li> Döndür özü-1 saat boyunca 4 ° C &#39;de boncuk karışımı. </li><li> 30 saniye için 4 ° C&#39;de 12,600 x g&#39;de mikrofüj içinde Spin özü boncuk karışımı. Alternatif olarak, manyetik boncuklar kullanıldığında, boncuk toplamak için manyetik bir alan uygulanır. </li><li> Aktarım buz üzerinde yeni bir mikrofüj tüpüne özü tükenmiş. Özü ile herhangi bir boncuk aktarmak için dikkatli olun. </li><li> Tükenmiş özü ve boncuklar hem imünolekelemeyle tükenmesi verimliliğini onaylayın. </li><li> 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi β-katenin indirgeme deneyi için özü hazırlayın. </li></ol></li><li> Xenopus β-katenin Bozulması Özü optimize Not: Xenopus yumurta özü β-katenin bozunma hızlı bir endojen ATP depolarını azaltan bir enerji-bağımlı bir süreçtir. Sonuç olarak, bir enerji dönüşüm sistemi güçlü bir β-katenin bozulmasını sağlamak için gereklidir. <ol><li> 150 mM kreatin fosfat aşağıdakilerden oluşan bir 20x enerjisi geri kazanımı (ER) karışım hazırlayın, 20 mM ATP, 600 mg / mL kreatin fosfokinaz,ve 20 mM MgCl2. ER -80 ° C&#39;de numune alınır ve saklanmalıdır Küçük dondurulmuş alikotları kullanılarak tekrarlanan donma / çözülme döngüsü kaçının. </li><li> Hızla elleri arasında donmuş tüp sürtünme tarafından Ksenopus yumurta özü eritin. Ekstrenin her eridikten hemen önce buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> Xenopus yumurta ekstresinin bir kısım (200 ul) içine enerji yenilenmesi karışımı (20x ER) 10 ul ekle. Hızlı boru ve darbe vorteks hafifçe vurarak iyice karıştırın. -Spin Darbe ve hemen buz üzerine yerleştirin. </li><li> (Isteğe bağlı) β-katenin devir hafifçe ubikitin (1.25 mg / ml nihai) ilavesi ile Xenopus yumurta özü geliştirilebilir. Sikloheksimid (nihai 0.1 mg / ml), aynı zamanda, endojen transkriptlerinin çevrilmesinin en aza indirmek için ilave edilebilir. </li><li> Buzda önceden soğutulmuş mikrofüj tüplerine bozulması tahlili için, uygun hacimleri kısım. Radyo-etiketli β-katenin bozulması deneyleri için, 2-5 ml her bir zaman noktası için geri çıkarmak. &#39;/ Li&gt; </ol></li></ol> Xenopus yumurta özü 3. Radyo-β-katenin indirgeme deneyi NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. <ol><li> Radyo-β-katenin hazırlanması <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak in vitro olarak sentezlenmiş [35 S] methionine-radyo işaretli protein taze hazırlayın. Not: Yaratma 35 (87 gün yarı-ömür) S-etiketli proteinler, kolay ve etkili bir şekilde ticari olarak temin edilebilir, in vitro transkripsiyon çiftli-çeviri kitleri kullanılarak üretilmektedir. Bu çevrilen protein yeterince protein devir değişiklikler kolaylıkla görselleştirilebilir şekilde işaretlenmiş olması önemlidir. </li><li> Başarılı radyolabelinge doğrulamak için, çevrilmiş proteinin 0.5 ul SDS-PAGE/autoradiography gerçekleştirin. ImageJ, ImageQuant, ya da alternatif bir kantitatif bir yazılım progr kullanılarak radyo-etiketlenmiş β-katenin bant yoğunluğunu ölçmekduyuyorum. NOT: radyoetiketlenmiş β-katenin protein bandı birkaç saat (4-6 saat) içinde filmde açıkça görülebilir olmalıdır. </li><li> Depolama için sıvı azot içinde radyo etiketli protein Gizlenebilir dondurularak kullanılana kadar. Not: Uzun süreli depolama (&gt; 2 ay) ve birden fazla donma / çözülme (2 &#39;den daha büyük) ciddi bir şekilde Xenopus yumurta özü sağlam indirgeme radyo-etiketli β-katenin kapasitesini etkileyebilir. Tipik olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş proteinlerin stabilitesi -80 ° C &#39;de depolama 1 ay sonra önemli ölçüde azalır; Bu şekilde nispeten taze hazırlanmış radyo-etiketli β-katenin, bu bozulma deneylerde iyi sonuçları verir. </li></ol></li><li> Β-katenin Parçalanma Testi gerçekleştirmek <ol><li> In vitro dönüştürülmemiş β-katenin 1-3 ul (radyo-etiketli bant sinyalinin gücüne bağlı olarak) ilave (ve diğer proteinler, test edilmektedir gibi küçük moleküller) buz üzerinde Xenopus Reaksiyon karışımı 20 ul halinde. Quickl ile iyice karıştırıntüp ve vorteks kısa bir darbe flicking y; Xenopus yumurta özü çok viskoz olduğu gibi bu önemli bir adımdır, ve eksik karıştırma sonuçlarının tutarlılığını etkileyecektir. Buz üzerinde nabız spin ve yer. </li><li> Oda sıcaklığına kadar tüpler kaydırarak β-katenin bozunma reaksiyonunu başlatın. </li><li> Belirlenmiş bir zaman noktasında, numunenin 1-5 ml çıkarın ve reaksiyonu durdurmak için SDS numune tamponu (5x hacim) ile hemen karıştırın. Emin olmak için bozunma reaksiyon tamamen şiddetle fiske tüpü, birkaç kez ve vorteks sonlandırılır. </li><li> SDS-PAGE/autoradiography gerçekleştirin. Her bir zaman noktası / şerit için ekstraktı 1 mL eşdeğer (~ 50 mg protein) çalıştırın. Xenopus yumurta özü β-katenin bozulması radyo-etiketli β-katenin bant Şekil 2&#39;nin yoğunluğu zamana bağımlı olarak azalmasına bağlı olmalıdır. ImageJ, ImageQuant veya diğer tercih edilen görüntüleme yazılımı gerektiğinde kullanarak sonuçları ölçmek. </li><li> (Optimumonal) arka plandaki radyoaktivitenin azaltmak ve görüntü kalitesini arttırmak için kurutmadan önce damıtılmış su) çözeltisi içinde (% 10 asetik asit ve% 30 metanol sabitleme SDS-poliakrilamid jeli bekletin. </li></ol></li></ol> Xenopus Yumurta Özü 4. Β-katenin-lusiferaz Parçalanma Deneyi Aksi belirtilmedikçe, buz üzerinde tüm adımları uygulayın. <ol><li> Β-katenin-lusiferaz hazırlanması <ol><li> Tam bir amino asit karışımı ile transkripsiyon-çevirme bağlanmış sistemi kullanılarak radyo-etiketlenmemiş, lusiferaz etiketli-β-katenin sentezlenmesi. </li><li> Reaksiyonun 0.5-1 ul lusiferaz aktivitesi ölçülerek lusiferaz etiketli β-katenin üretimini teyit edin. Çevrilmemiş Reaksiyon karışımı ışıltı ölçülerek arka plan aydınlığı değerlendirin. NOT: Birden çok kit lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi için kullanılabilir. Uzun ömürlü parlaklık Bununla birlikte, bozunma assa için özellikle iyi çalışıry. </li></ol></li><li> Β-katenin-lusiferaz Parçalanma Testi gerçekleştirmek <ol><li> Çözülme ve 2.2 olarak Ksenopus yumurta özü hazırlamak. </li><li> Buz üzerinde (2,2) hazırlanan Ksenopus reaksiyon karışımı içine in-vitro tercüme β-katenin-lusiferaz füzyon (4.1 dan itibaren) ekleyin ve 3.2.1 olarak iyice karıştırın. Not: ekstresine ilave edilir β-katenin lusiferaz aktivitesi, tipik olarak 20&#39;dir - 50000, göreli ışık birimi (4.1.2 elde edilen ölçümlerine göre) ekstresinin (RLU) / ml. Başlangıç ​​sinyali yaklaşık olarak 100.000 RLU (in vitro çevrilmiştir-β-katenin-lusiferaz füzyon 2-5 ml) az olmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığına özü Shift bozunma reaksiyonunu başlatın. </li><li> Belirtildiğinde, reaksiyonun bir kısım çıkarın ve ek sıvı azot içinde dondurulması. Not: Üç kopya numuneler tipik olarak, her bir zaman noktası için analiz için kaldırılır. Dondurulmuş özü -80 ° C&#39;de saklanabilir until bunlar analiz edilecek hazırız. </li><li> Çözülme örnekleri buz, buz üzerinde standart beyaz 96 oyuklu plakalara aktarımı örnekleri, ve lusiferaz aktivitesi için işlem. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway.">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li><li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-catenin+stability:+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract.">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts.">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li><li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts.">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li><li>Shennan, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+egg+extracts:+a+model+system+to+study+proprotein+convertases.">Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases.</a> Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).</li><li>Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cell+cycle+using+Xenopus+egg+extracts.">Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).</li><li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts.">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li><li>Masui, Y., Markert, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+control+of+nuclear+behavior+during+meiotic+maturation+of+frog+oocytes.">Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.</a> The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).</li><li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs.">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li><li>Newport, J. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+cell+cycle+during+early+Xenopus+development.">Regulation of the cell cycle during early Xenopus development.</a> Cell. 37, 731-742 (1984).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs.">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47, 577-587 (1986).</li><li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubistatins+inhibit+proteasome-dependent+degradation+by+binding+the+ubiquitin+chain.">Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain.</a> Science. 306, 117-120 (2004).</li><li>Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+ubiquitin-conjugating+enzyme+involved+in+mitotic+cyclin+degradation.">Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation.</a> Curr Biol. 6, 455-466 (1996).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+Wnt+signaling+through+activation+of+casein+kinase+1alpha.">Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha.</a> Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts.">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li><li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+state+of+protein+turnover:+It's+about+time.">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li><li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer.">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+regulation+of+[beta]-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon.">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kr&#252;ger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway.">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li><li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A.">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li><li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning.">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li><li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3's+phosphorylation+of+&#946;-catenin.">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of &#946;-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li><li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity.">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li><li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT/beta-catenin+signaling.">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+GSK3&#946;+to+the+APC-&#946;-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly.">Binding of GSK3&#946; to the APC-&#946;-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li><li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells.">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Xenopus yumurta özü β-katenin ciro araştırmak için sağlam bir biyokimyasal sistemidir. Xenopus yumurta özü β-katenin konsantrasyonu ~ 25 nM 2&#39;dir. Uygun koşullar altında, yumurta özü 50-100 nM / st &#39;lik bir oranda β-katenin parçalama yeteneğine sahip olan ve 200 nM, 24 yarı-maksimumdur. Xenopus yumurta özü kullanılarak β-katenin bozulması başarılı sulandırma için birkaç önemli adım vardır. Bu yüksek kaliteli Xenopus yumurt...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis yumurta özü sitoskeletal dinamikleri, nükleer montaj ve ithalat, apoptoz, ubikuitin metabolizması, hücre döngüsü ilerlemesi, sinyal iletimi, ve protein cirosu 1-17 dahil olmak üzere birçok hücre biyolojik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Yumurta özü aslında bu süreçleri yürütmek ve soruşturma sağlamak için gerekli tüm temel sitoplazmik bileşenleri içeren sulandırılmamış sitoplazmasını temsil ettiği Ksenopus yumurta özü sistem hücresel süreçlerin bir lejyon biyokimyasal analiz için uygun değildir. Yumurta ekstresi büyük miktarlarda malzeme (örneğin, protein saflaştırma veya yüksek verimli tarama) 18-20 büyük miktarlarda ihtiyaç biyokimyasal manipülasyonlar için aynı anda hazırlanabilirler. Diğer bir avantajı Xenopus yumurta özü spesifik protein konsantrasyonu tam olarak yeniden birleştirici protein ve / veya imüno-endog eklenmesi ile ayarlanabilir olmasıdırilgilenilen proteinin ekspresyonu kontrol etmek zordur, plazmid DNA transfeksiyonu aksine enous proteinleri. Buna ek olarak, mevcut rekombinant proteinlerin eksikliği eksogen olarak ilave mRNA çevirmek için taze hazırlanmış Xenopus yumurta ekstrakte yüksek kapasiteli yararlanarak, ilgi konusu proteini kodlayan transkriptlerin eklenmesi ile aşılabilir. Protein degradasyon düzenleme pek çok hücresel yollarının kontrolü için kritiktir ve 21,. Xenopus yumurta özüt sistem, transkripsiyon ve çevirinin karıştırıcı etki olmadan protein devir izlemek için çok sayıda yollar sağlar gibi protein degradasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır işler. Wnt sinyal yolu hastalığı geliştirme ve kritik roller oynayan bir yüksek ölçüde korunmuş bir sinyal yoludur. Β-katenin, Wnt yolu en önemli effektör devir, son derece artan bir kalıcı-hal yarım litre, veβ-katenin evel Wnt hedef genlerin aktivasyonu için kritiktir. Β-katenin bozulması önemi β-katenin bozulmasını engelleyen Wnt yolu mutasyonlar ~ kolorektal kanser 22 tüm sporadik vakaların% 90 olarak bulundu gerçeği ile vurgulanır. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması sadık olarak ciro mekanizması çalışma yanı sıra bozulma 2, 19, 20, 23-29 e ait yeni küçük moleküllü modülatörlerini tanımlamak için Xenopus yumurta özü değinmeyecek edilebilir. Hücre döngüsü incelemek için Xenopus yumurta ekstresinin hazırlanması için yöntemler önceki yayınlarda JoVE 30-32 &#39;de tarif edilmiştir. Mevcut protokol bu yöntemlerin bir modifikasyonunu açıklar ve bozulması için optimize edilmiştir [35 S]-radyo işaretli β-katenin ve lusiferaz etiketli β-katenin inXenopus yumurta özü. Radyo-etiketli bozulma deney otoradyografi ile protein seviyelerinin doğrudan görselleştirme için izin verir. [35 S] methionine daha sonra doğrudan bir bozulma reaksiyona ilave edilebilir bir in vitro çeviri reaksiyonu kullanılarak, ilgi konusu proteine ​​dahil edilebilir. Buna ek olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş protein devir tahlili protein istikrarı etkileyebilir ilgilenilen protein veya bir epitop etiketi, karşı bir antikor gerektirmez. Protein düzeylerindeki küçük değişikliklerin bile, radyo-etiketli protein bandının yoğunluğundaki değişiklikler yansıtılan kolaylıkla otoradyografi ile görselleştirilmektedir için, [35 S]-radyo işaretli bozunma protein tahlili devir 2 görselleştirilmesi için çok yararlı bir yöntemi temsil eder. Amacıyla, ateşböceği lusiferaz için β-katenin Fusion (bundan sonra sadece &quot;lusiferaz&quot; olarak anılacaktır), protein düzeylerinin kesin ve kolay nicel de elde edilebilirβ-katenin devir 19, 20 kinetik özelliklerini belirlemek için. Lusiferaz deneyi önemli bir avantajı kolay bir şekilde ölçeklenir güçlü bir kantitatif sistem sağlamasıdır. Aşağıdaki protokol β-katenin bozulmasını ve yeni β-katenin modülatörlerinin, yüksek miktarda madde taraması için sağlam, etkin ve etkili bir yöntem test etmek için basit bir yöntem sağlamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="710">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Material</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td style="width:132px;">ProSpec</td>
			<td style="width:119px;">hor-272-A</td>
			<td>Reconstituted with distilled water before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">S23020-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC42352-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC17360-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1153-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C8273-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe: Luer Lock tip</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">27G1 needle</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Steady-Glo Luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2520</td>
			<td>Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L3260</td>
			<td>Generally higher yield than reticulocyte lysate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]</td>
			<td style="width:132px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG772007MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">27920-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphokinase</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3755-35KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual-Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2920</td>
			<td>Same storage conditions as Steady-Glo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0556214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall SS-34 fixed angle rotor</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-090-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine Sp6 kit</td>
			<td style="width:132px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Firefly Luciferase antibody</td>
			<td style="width:132px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab16466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-GSK3 antibody</td>
			<td style="width:132px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FLUOStar Optima</td>
			<td style="width:132px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall RC-6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16&#176;C Incubator</td>
			<td style="width:132px;">Percival Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract

Xenopus laevis yumurta ekstresi. Xenopus yumurta özü, hücre döngüsü ve sinyal transdüksiyon yollarının 1-3 dahil olmak üzere birçok hücresel bağlamlarda protein dönüşümünü incelemek için kullanılmıştır çeşitli hücresel süreçlerin biyokimyasını incelemek için iyi karakterize edilmiş sağlam bir sistemdir. Burada, bir yöntem olup, Wnt yolu kritik bir bileşen, β-katenin degradasyonunu teşvik etmek için optimize edilmiştir Xenopus yumurta özü izole edilmesi için anlatılmıştır. Iki farklı yöntem Xenopus yumurta özü β-katenin protein degradasyonunu değerlendirmek için tarif edilmiştir. Diğer hali hazırda daha yüksek verimlilik deneyleri (ateş böceği lusiferaz etiketli füzyon proteinleri) için ölçekli bir yöntem ise, ([35 S]-radyo-etiketli proteinleri) görsel olarak bilgilendirici. Açıklanan teknikler β-katenin protein ciro değerlendirmek ve ciro katkıda molekül bileşenleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Buna ek olarak, öğrendiğilusiferaz etiketli proteinlerin sayısal ve kolay okuma ile birlikte homojen bir Xenopus yumurta ekstresi geniş hacimli arındırmak için ity bu sistem kolaylıkla β-katenin bozulmasının modülatörler için yüksek miktarda madde taraması için adapte edilmesine olanak sağlamaktadır.

Xenopus yumurta özü β-katenin bozulmasının bir şematik Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. 35 S-etiketli β-katenin Xenopus yumurta özü inkübe edildi, alikotlar (1 mi eşdeğer özü) uygun zamanlarda çıkarıldı ve numuneler tabi tutuldu SDS-PAGE ve ardından otoradyografi. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması, ubikitin-proteazom sistemi 2 tarafından aracılık edilir ve Xenopus özü [35 S]-radyo işaretli β-kat...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution Of Î²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract at JoVE.com

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Bir yöntem olup Xenopus yumurta özü ve protein degradasyon küçük molekül modülatörleri için yüksek miktarda madde taraması için uyarlanması radyoaktif olarak etiketlenmiş ve lusiferaz füzyon proteinleri kullanılarak protein degradasyonunu analiz edilmesi için anlatılmıştır.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Görüntüleme.  Vanderbilt University Medical Center.  Bir yöntem olup Xenopus yumurta özü ve protein degradasyon küçük molekül modülatörleri için yüksek miktarda madde taraması için uyarlanması radyoaktif olarak etiketlenmiş ve lusiferaz füzyon proteinleri kullanılarak protein degradasyonunu analiz edilmesi için anlatılmıştır. 

Video: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biyoloji

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta ayıklar

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Orofasial fenotipleri Niceleme<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).