Bu yöntem, doğum sonrası gelişim alanında süt emzirmenin beyindeki stres sinyalini nasıl etkilediği ne kadar önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, ilk doğal açlık döneminde belirli beyin bölgelerini yakalamak ve ilk doğal kolostrum yemi kısa bir süre sonra ilgili bölgelerle karşılaştırmak için kullanılabilir. Emzirmenin davranış ve duygu fizyolojisini nasıl etkilediğini anlamak, ex-vivo beyin dokusu analizi sırasında çeşitli reseptörlere karşı bir antagonist kullanılmasını sağlar.
Çekirdek yumrukları elde etmek için, eldivenli bir el ile kuyruğundan sıçan yavruları kaldırın. Beyin hasat sonra, hızla oda sıcaklığında bir polimetil metakrilat beyin kalıbına tüm organ yerleştirin ve hemen doku 500 mikrometre kalınlığında dilim yapmak için yeni bir jilet kullanın. Kesitlerin doğru yönünü korumak için elde edilen dilimleri petri kabına yerleştirin.
Tüm beyin kesitli olduğunda, hızlı bir şekilde çanak glikoz olmadan yapay beyin omurilik sıvısı ekleyin ve bir orbital shaker sürekli karıştırma ile 28-30 derece santigrat 60 dakika boyunca dilimleri kuluçka. Yumruklanacak beyin çekirdeklerini belirlemek ve kesiği yeni bir Petri kabına inceleyici mikroskop altında yerleştirmek için her dokuda bir beyin atlası ve anatomik işaretler kullanın. Görselleştirildikten sonra, 4 ila 6 farklı çekirdeği hızlı bir şekilde delmek ve her delikli çekirdeği proteus inhibitörleri ve fosfataz inhibitörleri içeren uygun şekilde etiketlenmiş mikro-santrifüj tüpüne 0,06 mL buz gibi protein çıkarma tamponuna hızla batırmak için bir yapıştırma aracı kullanın.
Kuluçka sonunda, soğutulmuş bir mini santrifüj içinde çıkarılan çekirdekleri santrifüj ve dikkatle buz üzerinde uygun önceden soğutulmuş 1,5 mL mikro-santrifüj tüp içine her tüpten supernatant 0.055 mL aktarmak için bir mikro pipet kullanın. Negatif 20 santigrat santigrat depolamadan önce, her protein stok tüpünden 0,012 mL süpernatant ı ilk numune hazırlama için buz üzerinde uygun 0,5 mL önceden soğutulmuş tüpe aktarın. Numuneleri kapiller protein ölçümü için hazırlamak için, protein lisis kitinden 0,5 mL etiketli tüplerdeki numunelerin her birine 0,003 mL ana karışım reaktifi ekleyin.
Daha sonra, 0,016 mL deiyonize su da bir biyotinylated moleküler ağırlık merdiven çözeltisi için master mix reaktif 0.004 mL ekleyin ve merdiven ve protein özü örnekleri 95 derece santigrat ısı bloğu, beş dakika sonra dört derece santigrat tüm tüpleri depolama. Sinyal protein analizi için, yeni bir otomatik Batı plakası olan E-1'den E-25'e kadar yeni hazırlanmış luminol peroksit çözeltisine 0,01 mL, D-2'den D-25'e kadar olan wells'e 0,01 mL ikincil anti-fare antikor ekleyin ve kitten D-1'e 0,01 mL streptavidin horseradish peroksidaz ekleyin. C-2'den C-25'e kadar yeni hazırlanmış primer antikorların 0,01 mL'sini ve B-25'e kadar olan kuyulara 0,01 mL antikor dilüent iki çözelti ekleyin.
F sırakuyularını boş bırakın ve F satırının altındaki üç satırın beş bölmesini 0,45 mL yıkama tamponuyla doldurun. Daha sonra, buzdolabındaki numuneleri 30 saniye boyunca kısaca döndürün ve A-2 ile başlayan a satırının her kuyusuna her numuneden 0,03 mL ekleyin. Daha sonra, iyi A-1 biyotinylated moleküler ağırlık merdiveni 0.005 mL ekleyin ve santrifüj için plaka kapağı.
Plaka santrifüj edilirken, otomatik Batı ilişkili yazılımda yeni bir çalışma dosyası açın ve moleküler boyut analizi başlatın. Test sayfasında, her kılcal damara örnek adlar ve birincil ve ikincil antikorların adlarını girin. Santrifüjün sonunda, plakayı otomatik Batı aletine yerleştirin ve kapağı kılcal kartuş kutusundan soyun.
Santrifüjden sonra, hava kabarcıklarını incelemeyi unutmayın, çünkü kılcal damardaki hava kabarcıkları elektroforetik akımı engelleyebilir ve tüm turda başarısız olabilir. Kartuşu cihazın içinde belirlenen konuma takın ve kapıyı kapatın. Başlat'ı tıklatın.
Tdenemenin türü yle birlikte istendiğinde, denemenin adını uygun metin kutusuna girin ve tamam'ı tıklatın. Etkinleştirilmiş çalıştırma tarihi ve çalıştırma dosyasındaki kimlik numarası istendiğinde, çalıştırmanın ne zaman sona erdiğini not edin. Koşunun sonunda, kılcal kartuşun keskinlik lerin bertaraf edilmesine ve plakayı biyolojik tehlikeli maddelerin bertaraf edilmesine atın.
Elektroforez ayrımından sonra, fosforilasyonlu ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A'yı temsil eden 40-43 kilodaltonantijenantijenlerin immün reaktivite zirveleri için çalışma dosyalarını kontrol edin. Bu boyuttaki molekül ağırlığı zirvelerinin eksik olduğu durumlarda, eğrinin altına sağ tıklayın ve eğrinin altındaki boyutların ve rasgele miktarların kaydedilmesini sağlamak için zirveye moleküler ağırlık eklemeyi seçin. Unprimeds doku örnekleri içinde, yalnız parçanın çekirdeklerinde bağlayıcı amino globulin protein düzeyleri diğer bölgelerin tümgöre anlamlı olarak daha yüksektir.
Kolostrum ile bağırsak dokusunun priming yalnız parçanın çekirdeklerinde bağlayıcı amino globulin protein düzeylerini azaltır ve paraventriküler çekirdekleri ve süper optik çekirdekleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Tersine, priming korteks içinde amino globulin protein düzeylerini artırır, striation çekirdekleri, ve medial preoptik çekirdekleri unprimed dokuya göre, çeşitli test beyin çekirdeklerinde bağlayıcı amino globulin protein düzeyleri bağırsak astar farklı tepki ve henüz test edilen çeşitli çekirdekler arasında herhangi bir göstermiştir çapraz konuşma olduğunu ima. Ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A ve fosforilasyonlu ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A düzeyleri diğer çekirdeklere göre asal olmayan durumda yükselir.
Astarlamadan sonra hem ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A hem de fosforilasyonlu ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A düzeyleri, astarlanmamış dokuya göre tek başına pistin çekirdeğine göre azalır. Diğer tüm test edilmiş çekirdeklerde primer, ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A ve fosforilasyonlu ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A'nın asal olmayan dokuya göre düzeylerini artırır. Ancak, fosforilasyon protein kiziaz reseptör düzeyleri soliter parçanın çekirdeklerinde astarlanmış örneklere göre astarlanmamış örneklerde düşüktür, kuvvetle başka bir kiazaz ökaryotik çeviri başlatma faktörü 2A fosforilasyon dahil olduğunu düşündürmektedir.
Bu teknik, gelişiminden sonra, doğum sonrası gelişim alanında araştırmacıların doku büyümesi ve farklılaşmasında rol oynayan sinyal yollarını ve emzirmeden etkilenip etkilenmediklerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Örneğin, dithiothreitol gibi uçucu azaltıcı ajanlarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü hazırlarken kimyasal başlıkta hazırlık gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
