Bu in vivo fagositoz tahlili, araştırmacıların yetişkin kan hücrelerinde fagositozdüzenleyen yeni genleri belirlemek için genetik ekranlar ve genom çapında ilişki çalışmaları yürütmek için izin verir. Bu deney niceldir, gerçekleşebilir ve patojen tanıma, alım ve temizliği etkileyen konak faktörleri için canlı hayvanların taranmasına uygulanabilir. Bir iğne çekmeceile ince duvarcam kılcal paralar çektikten sonra, bir mikrometre bir mikroskop altında iğne tutmak için bir mikrometre kullanın ve 100 mikrometre ucu çapı ucu kırmak için beş numara, ince nokta, paslanmaz çelik cımbız kullanın.
Her sinek içine enjekte edilecek sıvı hacmini ölçmek için, PBS steril% 5 gıda boyama ile bir kılcal iğne yük ve 0.01 milimetrelik sahne mikrometre mineral yağ bir damla üzerine sıvı dışarı atmak. Mililitre parçacıkbaşına 10 mikrolitrelik 1.6 miligramı Parafilm'in küçük bir karesine dağıtın ve sıvıyı iğnenin içine çekin. İğneyi enjektör başlığına yerleştirin ve anesteziye dayalı sinekleri sineklikte belirlenen alan boyunca, havalandırma tarafını yukarı, kafaları yastığın önüne doğru yönlendirerek hizaya getirin.
Şişeleri banktaki ilgili alanlara yerleştirin ve toplam 10 nanolitre partikül sağlamak için karının üst köşesindeki sinekleri beş, 100 milisaniyelik sıvı pompalarıyla enjekte edin. Her sinek enjekte edilir gibi uygun şişe içine transfer, şişe üzerinde zaman belirterek. Daha sonra, %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin ve pnömatik enjektörü, sıvıyı iğneden dışarı itmek için sabit bir hava akışını sağlamak için kapılı olarak ayarlayın.
İlk enjeksiyondan 30 dakika sonra, karınlar dolana ve şişmiş olana kadar her sinek karnına Trypan Mavisi enjekte edin. Sinekleri elektrik bandı ile mikroskop kaydıraklarına monte edin, ventral tarafı aşağı, kanatları sineğin kenarına iterek onları banta sabitleyin. Daha sonra, sineğin hareket etmeyeceğine emin olmak için başı yavaşça teybin içine itin.
Hemen sonra tüm sinekler güvenli, görüntü böcekler, birer birer, bir dijital kamera ve bilgisayara bağlı ters floresan mikroskobu üzerinde 25 veya 32 kez büyütme, dijital kamera için bilgisayar yazılımı kullanarak her sinek sırt gemisi odaklanarak. Ardından, pozlama süresini ve deneyler arasındaki büyütmeyi kaydedin. Floresan ölçmek için uygun bir görüntüleme analiz programı açın ve bir görüntü açın.
Sırt damarının floresan yoğunluğunu ölçmek için, sırt damarının etrafına bir poligon çizin ve poligon içindeki floresan yoğunluğunu kaydetmek için Ölçü'ü seçin. Arka plan floresan yoğunluğunu belirlemek için, ilk çokgenkopyalayın ve her sinek sırt damarı bitişik bir alana taşıyın. Ardından, Ölçü'ü seçin ve arka plan alanının floresan yoğunluğunu kaydedin.
Sırt damarı floresansını arka plan floresansı ile normalleştirmek için, sineklerin geri kalanının floresan yoğunluklarını ölçtükten sonra, sırt damarı floresansını arka plan floresansına bölün ve tüm sineklerin ortalama normalleştirilmiş sırt damarı floresan yoğunluğunu tek bir süzme içinde hesaplayın. Bir elektrik bandının üzerine ventral tarafı aşağı monte edildikten sonra, dorsal damarın bulunduğu karının ilk iki bölümü açıkça görülebilir. Deneysel hatanın temel kaynakları prosedürün enjeksiyon ve görüntüleme adımlarında ortaya çıkar.
Birden fazla sinek enjekte etmek için aynı iğneyi kullanmak, sinek dokusu veya parçacıkları ile tıkanmasına neden olabilir. Tüm karın boyunca parlak bir şekilde yeterli Trypan Mavi floresan almayan sinekler, sırt damarının arka plan floresanlarına oranını azaltarak hayvanın gerçek floresan yoğunluk oranını düşürür. Aktif olarak hareket eden sinekler ölçülemeyen bulanık görüntüler ürettiği için, sinekler karbondioksit tarafından hareketsiz hale getirilirken fotoğraflanmalıdır.
Etil metansülfonat ile tedavi sineklerin Zuker koleksiyonundan bir mutant hattı gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerfagositoz ve in vivo fagositoz testi neredeyse hiç dorsal damar floresan görüntüler, izojenik arka plan Zuker suşu ve başka bir ortak laboratuvar kontrol suş eşleştirilmiş. Sineklerin görüntülendiğinde patojen tanıma ve alımının karşılaştırılabilir aşamalarında olduğundan emin olmak için sineklerin enjekte edildiği zamanı ve sırayı takip edin. Fagositik defektlerin altında yatan moleküler mekanizmalar konfokal mikroskopi ile tek hemositler incelenerek veya floresan aktive hücre ayrıştırması sonrası veya erişkin hemositlerin manyetik boncuk izolasyonu ile belirlenebilir.
