Karaciğerde doğuştan gelen metabolizma hatalarının tedavisinde ek vivo gen tedavisi ve otolog hücre nakli bu hastalıkların tedavisine önemli bir alternatiftir. Ve bize sadece bu bozuklukları tedavi etmek için izin verir, ama biyokütle terapötik bir sonuç elde edebilmek için gerekli anlamaya. Bu yaklaşım aynı zamanda farklı tedavi türleri ile immünsupresyon ve diğer sonuçları önemli sonuçları önler.
Mevcut bağlamda, kalıtsal tyrosinemia tip 1 tedavisinde bu yaklaşımı kullanıyoruz. Ancak, fikir bu minimal değişiklik ile farklı karaciğer hastalıklarının çok sayıda tedavi etmek için bir platform yaklaşım olacaktır. Bu tekniği görselleştirebilmek önemlidir, çünkü perfüzyonun verimliliğini görselleştirmek söz konusu olduğunda bazı değişkenlikler vardır, ki bu da transplantasyon için uygun hepatosit elde etmek için gereklidir.
Robert Kaiser ve Joseph Lillegard tarafından yapılan cerrahi işlem. Zeji Du, Bruce Amiot tarafından gerçekleştirilen hücre izolasyonu. UAU hücre arınması ve hücrelerin ex vivo transdüksiyonu Caitlin VanLith tarafından yapıldı.
Hayvanların hazırlanması ve ameliyatla hazırlık Kari Allen ve Laurie Hillin tarafından yapıldı. İlk liman sitesi girişini gerçekleştirmek için, üç aylık, büyük, beyaz çiftlik domuzuna kadar, anestezili bir domuzun göbek yumbilicus'una açık bir Hasson tekniğini gerçekleştirin. Karın boşluğuna 12 milimetrelik bir trokar girişi, periton görünür.
Trokar yerinde olduğunda, giriş portu üzerinden 5 milimetre 30 derecelik bir kapsam geçmek ve cıva 15 milimetre karbondioksit ile karın insufflate. Laparoskopik kamera ile doğrudan görselleştirme altında, 2 ek 5 milimetrelik bağlantı noktaları yerleştirin, karaciğerin sol lateral lob üzerinde üçgenleme. Ve laparoskopu yeni limanlardan birine yerleştirin.
Medial ve sol lateral segmentleri ayıran sol lob büyük çatlak noktasında karaciğerin sol lateral segmentini tanımlayın. Ve bu çatlak boyunca vasküler yapıları ve hepatik ven güvenli bir cerrahi zımba kullanın. Sıralı ateşlemeler ve 60, 45 veya 30 milimetre uzunluğunda damar yükleri kullanarak bu çatlak yoluyla paraenkim transect.
Rezeksiyon tamamlandığında, yeterli hemostaz sağlamak için kalıntı karaciğer değerlendirmek ve karaciğer bölümünü almak için endoskopik kavrayıcılar ve endoskopik doku alma torbası kullanın. Şimdi, bağlantı noktalarını kaldırın ve orta hat fasya için kesilen boyutu sıfır dikiş kullanın. Derin dermal tabaka için çalışan 2-0 dikiş.
Ve subcutiküler tabaka için çalışan 4-0 dikiş, üç katmanda 12 milimetrelik bağlantı noktası kesisini kapatmak için. Daha sonra beş milimetrelik bağlantı noktalarını 2-0 dikişlerle tek bir katmanda kapatın. Ve kesiklerin üzerine steril bir pansuman yerleştirin.
Hepatosit izolasyonu için, ilk olarak 43 derece santigrat su banyosunda muhafaza edilen dağılım çözeltilerini karaciğer bölümünün büyük, maruz kalan damarlarına yerleştirilecek kateterlere teslim etmek için ayarlanmış bir peristaltik pompayı bağlayın. Prime pompa ve perfüzyon iki çözüm ile tüp, kadar bir stop horoz pozisyonuna kadar perfüzyon bir ve perfüzyon iki çözüm dokuya teslim arasında geçiş yapmak. Ve perfüzyon bir konuma stop horoz değiştirin.
Sonra boru seti geri kalanı astar. Tamamen doku içine hava kabarcıkları girmesini önlemek için bir satır lı kabarcık tuzak doldurma. Daha sonra, portal ven dalları ve kateterizasyon için hepatik venlerin kesitlerini ortaya çıkarmak için hepatik dolaşıma dik, temiz bir enine kesi yapın.
Ve mevcut, maruz damarları kateterize etmek için rahat bir uygun kateter kullanın. Kateterler yerinde olduğunda, rezeke edilmiş karaciğer dokusunu dakikada 100 milimetrelik akış hızında sıcak perfüzyon bir çözeltiile perfüzyon. Çıkış tüpünü her 30 ila 60 saniyede bir damardan damara taşımak.
Ve doku tepsisinden fazla tamponu çıkarmak için bir tahliye tüpü kullanmak. 15 ila 20 dakika boyunca mevcut damarların tüm üzerinden bisiklet sonra, aynı koşullar altında perfüzyon iki çözüm geçmek. Perfüzyon iki çözeltigeri rezervuar geri dönüşüm için bir dönüş pompası kullanarak, daha yavaş bir akış hızında, doku içine yeniden yönetimi için.
Hepatositlerin soğumadığını doğrulamak için kabarcık kapanının yüzey sıcaklığını ve karaciğeri her beş dakikada bir kontrol edin. Karaciğer perfüzyon yaklaşık 30 dakika sonra beyazlatma, steril bir drap ile sarılmış steril bir konteyner için doku transferi, ve hepatosit işleme sırasında kısırlık korumak için bir hücre kültür başlık içine konteyner yerleştirin. Hepatositlerin kollajenaz izolasyonu ve hücre ayrışması tamamen yapılmalıdır, böylece hücrelerin canlılığını ve transdüksiyon frekansını azaltan hücrelerde kümelenme olmaz.
Karaciğer kapsülü bozmak için hepatosit yıkama orta ve doku üst boyunca makas sürükleyin ile karaciğer batırın. Steril eldiven ler giyerek, hepatositleri ortama salmak için karaciğere hafifçe masaj. Ve steril gazlı bezle 200 mililitre santimetrelik santimetre şişeye doku süpernatant filtre.
Filtrelenmiş hepatositleri santrifüj ile toplayın. 150 mililitre taze hepatosit yıkama orta 200 mililitrelik şişe içine 2 ek yıkar için hücreleri havuzlama. Ve üçüncü santrifüjden sonra hücreleri saymak.
Daha sonra, mililitre tuzlu konsantrasyonbaşına dokuzuncu hepatosit 1 kez 10 hücreleri seyreltin. İzole hepatositlerin ototransplantasyonu için, ultrason yoluyla portal damarı tanımlamak için iki-beş megahertz dönüştürücü kullanın ve beş inç, 18-gauge iğneana portal damar doğru doğrudan, bu bifurkasyon yaklaşık. Hücreleri toplam hücre hacmine göre 60 mililitrelik şırıngayükleyin ve şırıngayı iğneye takın, kabarcıkları tanıtmamaya özen takın.
Daha sonra, nakil sırasında poral basıncı izlemek için bir infüzyon kateter kullanarak portal ven yoluyla 1 kez 10 dokuzuncu hepatositler kadar elle aşılamak için şırınga piston yavaş yavaş bastırın. Tüm hücreler teslim edildiğinde, kateteri çıkarın ve trombotik olayların varlığı ve ultrason ile ileri akışı için portal ven izlemek. Hepatik rezeksiyon yapılan beş domuzdan oluşan temsili bir kohortta, çoğu yaklaşık %80 canlılığa sahip 10'dan dokuzuncu hepatosite kadar verime sahipti.
Gen terapisi de dahil olmak üzere istenilen manipülasyon her türlü için yeterli sayıda hücre sağlanması. Bu hazırlanan hepatositlerin nakledilmeyen kısmının sonraki kültürü, transdüksiyon ve ilk kaplamadan 46 saat sonra tipik bir hepatosit morfolojisi ile iyi bir canlılık ve yapVizyon göstermiştir. İlk engraftment transplantasyon sırasında yeniden getirilen hücre sayısına göre değişir.
Bu temsili biyopsiler gen düzeltilmiş hücre genişlemesinin bir zaman çizelgesini gösterir. Kalıtsal tyrosinemia tip 1 gibi sağlıklı hücreler için pozitif seçilmiş bir baskıya sahip hastalıklara özgü. Bu genişleme genellikle transplantasyondan 12 ay sonra tamamlanır.
Nakledilen fumarylacetoacetate hidrolaz nakavt hayvan karaciğer içinde düzeltilmiş hepatositlerin yaklaşık% 20 yeniden nüfus elde ettikten sonra, tirozin düzeyleri vahşi tip hayvanlara göre normale dönecektir. Düzeltilmemiş hayvanlar yabani hayvanlara göre hem alkali fosfataz hem de aspartat transaminazda önemli bir yükselme gösterirken, ex vivo gen tedavisi bu serum enzimlerini normale döndürür. Ayrıca, tedavi edilmeyen nakavt domuzlarda genel karaciğer metabolik sağlığı bozulur, tedavi edilen hepatositler ile yeniden popülasyondan sonra düzeltilen dolaşımdaki amonyadaki yükselmelerde belirtildiği gibi.
Bu tekniği kullanarak kullanımı ile işlemek ve dikkatli ve mümkün olduğunca az doku işlemek önemlidir. Artan işleme veya doku manipülasyonu, hücrelerin canlılığını azaltmak ve verimi azaltmak için yol açar. Bu yaklaşım, viral transdüksiyon protokolleri dışındaki diğer teknikleri kullanarak, etiketleme tekniklerinde yay dağıtımı ve grafik verimsizlikleri üzerinde çalışmak isteyen kişiler için de uygulanabilir.
Viral vektörler ile çalışan tehlikeli olabilir unutmayın, bu yüzden uygun biyo güvenlik prosedürleri aşağıdaki, hem de kişisel koruyucu ekipman giyen bu teknikleri kullanırken gereklidir.
