Tek hücreli RNA dizilimi, özellikle merkezi sinir sistemi gibi heterojen dokularda hücrelerin transkripsiyonel profillerini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, tek çekirdekli RNA dizilimi için çekirdekleri yalıtmak için bir yöntem sağlar. Hücreler yerine çekirdekler kullanılarak, bu yöntem zor ayrıştırılan dokulara ve donmuş dokulara uygulanabilir.
Ayrıca, bu yöntem hastalık veya yaralanma sonrası hücrelerde hücre tipine özgü değişiklikleri incelemek için uygulanabilir. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi fare ötenazisi ile başlayın. Sonra, iç organları ortaya çıkarmak için vücudun uzunluğu boyunca bir kesi yapmak.
İç organları vücut boşluğundan forceps kullanarak çekerek fareyi boşaltın. Bu kirletici maddelere neden olabilir gibi, bölgeyi temizlemek veya organları kaldırmak için kağıt havlu kullanmayın. Makas kullanarak, L2 ve L3 spinal vertebra arasındaki vertebral kolon kesti.
Omurilik çıkarmak için, bir 25 gauge 1 / 4 inç iğne ile buz gibi PBS içeren üç mililitrelik şırınga uygun. İğneucunu vertebral sütunun sakral ucuna yerleştirin. İğneucu etrafında sıkı bir mühür oluşturmak için omurları çimdik iki parmak kullanın ve omurilik rostrally çıkarmak için piston aşağı basın.
Buz gibi PBS ile bir Petri kabına omurilik yerleştirin. Kordonun lomber kısmı gerekiyorsa, omuriliğin sakral ve torasik kısımlarını kesin. Bu noktada, eksi 80 santigrat derece doku dondurun veya metin protokolünde açıklandığı gibi deterjan mekanik hücre lisis veya hipotonik mekanik lysis için hemen kullanın.
Deterjan mekanik hücre lizis belirlemek için, önceden soğutulmuş Dounce homogenizer bel omurilik yerleştirin ve önceden soğutulmuş deterjan lizis tampon 500 mikrolitre ekleyin. Gevşek havaneli beş vuruş ile dounce, A, ve sonra sıkı havaneli beş ila 10 vuruş, B.Vuruş arasında lizis çözeltisi dışında homogenizer kaldırma kaçının, ve kabarcıklar tanıtmakkaçının. Şimdi, önceden soğutulmuş 50 mililitrekonik tüp ve önceden ıslak bir mililitre düşük sakaroz tampon ile 40 mikron süzgeç yerleştirin.
Lysis tamponundaki ham çekirdekleri içeren Dounce homogenizer'e bir mililitre düşük sakaroz tamponu ekleyin ve 2-3 kez borulandırarak hafifçe karıştırın. Ham çekirdekleri 40 mikronluk süzgeç üzerinden önceden soğutulmuş 50 mililitrelik konik tüpe geçirin. 40 mikronsüz süzgeç üzerinde ek bir mililitre düşük sakaroz tampon geçirin, düşük sakaroz tampon üç mililitre ve lysis tampon 500 mikrolitre son hacmi getirerek.
Aynı konik tüpte soğutma, birden fazla kablo birleştirerek bu adımları tekrarlayın. Daha sonra, numuneyi 3200 kez G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Santrifüj tamamlandıktan sonra, supernatant decant.
Paleti üç mililitre düşük sakaroz tamponu kullanarak askıya alıyoruz. Yavaşça geri süspansiyon kolaylaştırmak için duvardan pelet kaldırmak için girdap. Numunenin iki dakika buzda olmasına izin verdikten sonra süspansiyonu Oak Ridge tüpüne aktarın.
Birinci ayarda homogenizer kullanarak, düşük sakaroz tampon çekirdekleri homojenize 15-30 saniye, buz üzerinde örnek tutmak. Daha sonra, düşük sakaroz tampon homojenate altında, yoğunluk sakaroz tampon 12,5 mililitre katman için serolojik pipet kullanın, yoğunluk katmanları bozan bir kabarcık oluşturmak için değil dikkat. Tüpleri 3200 kez G'de, 20 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Santrifüj tamamlandıktan sonra, hemen bir hareket supernatant decant. Bu prosedürü çalışırken, hemen santrifüj gelen Oak Ridge tüp kaldırmak için hatırlamak önemlidir, ve hızlı bir şekilde supernatant decant. 100 mikrolitre ile bir mililitre resuspension çözeltisi kullanarak duvarda kalan çekirdekleri askıya alıyoruz.
Deterjan bazlı hazırlık ile kalır miyelin kaşlarını kaçının. Bu adımların hızlı bir şekilde yapılmaması, aşırı hücresel enkaz veya miyelin ile çekirdek hazırlığına neden olabilir, bu da tek çekirdekli RNA diziliminin aşağı yayılışını engelleyebilir. Çekirdekleri 30 ila 35 mikron gözenek boyutunda bir süzgeçten süzün ve önceden soğutulmuş bir tüpte toplayın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi tek çekirdekli RNA sıralamasına geçmeden önce çekirdek verimini 10 x hedefi altında saymak için bir hemositometre kullanarak çekirdek verimini belirleyin. Deterjan mekanik lysis protokolü kullanılarak izole edilen çekirdeklerin parlak alan ve epifloresan görüntüleri 10 x olarak gösterilmiştir. Bu çekirdekler tarafsız bir şekilde izole edilerek, tek bir hücre düzeyinde endojen gen ekspresyonu profillerinin incelenmesine olanak sağlar.
Burada gösterilen, tek çekirdekli RNA sıralama temsili bir tSNE arsa, bir fare lomber omurilik, bir kitlesel paralel damlacık kapsülleme platformu kullanarak. Taze veya dondurulmuş dokudan izole edilmiş çekirdekler hem ticari hem de akademik platformlarda dizileme için kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların transkripsiyonel profilleri tek hücre düzeyinde keşfetmelerini sağlar, omurilik gibi ayrıştırılaması zor dokuları, hatta biyobank materyali gibi dondurulmuş dokuları kullanırlar.
Bu prosedürü çalışırken, ötanazi ve hücresel lisis arasındaki süreyi azaltmak önemlidir. Ayrıca, hücresel lysis resuspension için çözümler içine tanıtılan kabarcıklar en aza indirmek için önemlidir, ve özenle evcil hayvan çekirdekleri satın almak için. Bu yordamı takiben, çekirdekler belirli hücre türlerini izole etmek için facs sıralama gibi alternatif uygulamalar için kullanılabilir.
