Negatif FACS sıralama kullanarak nöronları dışlama stratejisi, yetişkin hipokampal nörogenezin modülasyonundaki rollerini incelemek için nöral kök hücreler, astrositler ve oligodendrositler gibi düşük bolluktaki hücre popülasyonunun yüksek kaliteli RNA dizileme oranlarını üretir. Bu yöntemle, FACS gating'deki antikor seçimini uyarlamak mümkündür, bu da bu protokolü dentat girus ile ilgili çeşitli biyolojik soruları ele almada çok yönlü kılar. Bu yöntem öncelikle yetişkin hipokampal nişi araştırmak için tasarlanmıştır.
Bununla birlikte, diğer kök hücre nişlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Prosedürü gösteren, Francis Crick Enstitüsü'nde doktora sonrası eğitim görevlisi Sara Ahmed de Prado olacak. Başlamak için, ötenazi faresinden disseke edilmiş beyni, buz gibi soğuk PBS ile dolu 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın.
Sonra Petri kabını buzun üzerine yerleştirin ve beyni sagital eksen boyunca iki yarıya bölün. Bir neşter kullanarak, beyinciği çıkarın. Beynin yarısını, buz gibi soğuk PBS içeren buz üzerine yerleştirilmiş yeni 10 santimetrelik Petri kabına aktarın.
Dürbün kullanarak dentat girus veya DG'yi disseke edin ve beynin ikinci yarısından ikinci DG'yi elde etmek için bu adımı tekrarlayın. İki DG'yi önceden soğutulmuş Dounce homojenizatörüne aktarın ve 1 mililitre soğuk homojenizasyon tamponu veya HB ekleyin. Dokuyu gevşek A havanesinin 10 vuruşuyla, ardından sıkı B havanesinin 15 vuruşuyla homojenize edin. Homojenatı önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Dounce homojenizatörünü 1 mililitre soğuk HB ile durulayın ve aynı tüp ile birleştirin. 15 mililitrelik tüpe 3 mililitre HB ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Bu çekirdek süspansiyonunu, tüpü yavaşça ters çevirerek iki kez karıştırın.
0,5 mililitre HB kullanarak, 50 mililitrelik bir test tüpünün üzerine yerleştirilen 70 mikrometrelik süzgeç kapağını önceden ıslatın, ardından hücre süzgecini 0,5 mililitre HB ile yıkamadan önce çekirdek süspansiyonunu süzün. Daha sonra, hücre süzgecini çıkarın ve test tüpünü, 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 500 x g'de bir salıncak kovası santrifüjünde santrifüj yapın. Süper natantı atın. P1000 pipet kullanarak peleti 4 mililitre HB içinde nazikçe yeniden askıya alın.
Buz üzerinde 5 dakikalık inkübasyondan sonra, süspansiyonu 10 dakika boyunca 500 x g'de, 4 santigrat derecede santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti 3 mililitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. 35 mikrometrelik süzgeç kapağını 50 mililitrelik bir test tüpü üzerinde önceden ıslatmak için 0,5 mililitre yıkama ortamı kullanın.
Ardından, bir P1000 pipet kullanarak bir seferde 0,5 mililitre süspansiyon pipetleyerek çekirdek süspansiyonunu süzün. Süzgeç kapağını 0,5 mililitre yıkama ortamı ile yıkadıktan sonra, tüpü buzun üzerine yerleştirin. Filtratın yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve 500 x g'de 5 dakika ve 4 santigrat derece santrifüj yapın.
Süper natantı atın ve peleti 3 mililitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve fare anti-NeuN, Alexa Fluor 488 konjuge antikoru ve mililitre DAPI başına 1 mikrogram ile peleti 1 mililitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. Karanlıkta buz üzerinde 45 dakika boyunca reaksiyonu inkübe edin.
Floresan aktif çekirdek sıralama veya FANS için, immün boyalı çekirdek süspansiyonunu 5 mililitrelik bir test tüpüne aktarın ve akış sitometrisi prosedürünün başlangıcına kadar buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri FACS cihazına yerleştirmeden önce numuneleri 3 saniye boyunca, hafif yoğunlukta vorteksleyin. Verileri lekeli çekirdek süspansiyonundan elde etmek için, hücre kalıntılarını ve toplanmış çekirdekleri dışlamak için kapıları DAPI yüksekliğinde ve DAPI alanında ayarlayın.
Ardından, tek çekirdekleri kalan DAPI lekeli agrega veya hücre kalıntılarından ayırmak için günlük tarafı saçılımındaki veya SSC, alanındaki ve günlük ileri saçılımındaki veya FSC alanındaki kapıları ayarlayın. Daha sonra anti-NeuN-AF488 ve FSC alanı için kapıları ayarlayarak NeuN-AF488-negatif popülasyonu izole edin. Analizden sonra, anti-NeuN-AF488 negatif popülasyonunu, geçit stratejisini kullanarak 50 mikrolitre yıkama ortamı ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik bir toplama tüpünde sıralayın.
Sıralama yapıldıktan sonra, tüpün duvarından damlacıkları toplamak için toplama tüpüne% 1 sığır serum albümini veya BSA içeren 1 mililitre PBS ekleyin ve tüpü 500 x g'de, 5 dakika boyunca, 4 santigrat derecede santrifüj edin. Süper natantı atın ve santrifüjlü çekirdekleri yeniden askıya almak için 50 mikrolitre çözünür bırakın. 0.5 mililitrelik bir mikrotüpte, 5 mikrolitre Tripan mavisine 5 mikrolitre çekirdek süspansiyonu ekleyin.
Konsantrasyonu ölçün ve çekirdeklerin kütüphane hazırlığını ve dizilimini gerçekleştirmeden önce otomatik bir hücre sayacı kullanarak tek hücreli süspansiyonun canlılığını değerlendirin. Biyoinformatik kümeleme, FANS'lı veya FANS'sız DG içindeki bilinen hücre tiplerine karşılık gelen iyi ayrılmış çekirdek gruplarını ortaya çıkardı. FACS'a göre sıralanmamış örnekte, yüksek kaliteli dizilenmiş çekirdeklerin çoğu nöronların% 84.9'uydu.
Üç nöron grubundan oluşuyordu ve dentat girustaki en temsili hücre popülasyonlarının granül nöronlar, diğer uyarıcı nöronlar ve inhibitör nöronlar olma olasılığını gösteriyordu. FACS-sıralanmamış örnekte, tanımlanan nöronal olmayan kümeler çoğunlukla, astrositler, oligodendrositler ve oligodendrosit öncü hücreleri,% 3.3 bağışıklık hücreleri ve% 0,6 Cajal-Retzius hücreleri dahil olmak üzere glial hücre tiplerinin% 11.1'inden yapılmıştır. NeuN pozitif popülasyonlarını dışlamak için FANS yaparken, glial hücre kümeleri toplam çekirdeğin% 81.3'ü ile belirgin hale geldi.
Çekirdek başına 50.000 okumada sıralanan örnekler için, FACS-sıralanmamış örnek için çekirdek başına 25.010 gen ve NeuN-negatif FANS örneği için 1.665.5 gen tespit edildi, bu da tek çekirdeklerin yüksek kaliteli transkriptomik profillemesini ve FACS sıralamanın sonraki snRNA-seks için çekirdeklere zarar vermediğini doğruladı. FACS-sıralanmamış örneklemdeki nöronların yüksek oranı, FACS-sıralanmamış örnekte çekirdek başına 2.660 gen ve çekirdek başına 6.170 transkript transkripsiyonel aktivitesine, çekirdek başına ortalama 1.090 gen ve çekirdek başına 1.785 transkripsiyonel aktiviteye sahip nöronal olmayan hücre tiplerine göre daha yüksek bir transkripsiyonel aktiviteye sahipti. Veriler bu protokolle oluşturulduktan sonra, herhangi bir bulguyu doğrulamak için özel semptomlar veya in vivo çalışmalar gibi bu yeni ortogonal yöntemleri göz önünde bulundurmaya değer.
