Bu yöntem, örneklerin Zika virüsü içerip içermediğini hızlı bir şekilde belirleyebilir. Bu, hamile kadınlar, gebe kalmaya çalışan çiftler veya Zika enfeksiyonu riski altında olan yerel sivrisinek popülasyonlarının izlenmesi için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, hızlı, kolay, pahalı ekipman gerektirmez ve rna izolasyon adımı olmadan yapılabilir.
Bu tekniğin sonuçları Zika enfeksiyonunun tanısına kadar uzanır, çünkü gebelik sırasında enfeksiyon düşük, ölü doğum ve diğer ciddi konjenital, nörolojik doğum kusurları ile bağlantılıdır. Bu yöntem Zika'ya ışık sağlasa da, virüse özgü astarlar kullanılarak dang, chikungunya veya Batı Nil virüsü gibi diğer bulaşıcı hastalıklara da uygulanabilir. Başlamak için, moleküler sınıf sudaki her RT-LAMP astarını 100 mikromolar son konsantrasyona yeniden oluşturun.
Çözeltinin homojen olduğundan emin olmak için astar çözeltisini kısaca girdaplayın. Astar çözeltisini toplamak için maksimum hızda yaklaşık beş saniye santrifüj yapın. Daha sonra teknoloji protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi 10x RT-LAMP astar karışımı hazırlayın.
Vortex kısaca homojenliği sağlamak için. Ve herhangi bir kaybı önlemek için maksimum hızda kısa bir süre santrifüj. Astarları eksi 20 santigrat derecede, kullanımlar arasında saklayın, herhangi bir donma-çözülme döngüsünden kaçının.
İnsan idrar örnekleri için, koruyucu taze idrar, dondurulmuş idrar veya idrar kullanın. Kullanmadan önce buz üzerinde herhangi bir dondurulmuş örnekleri eritin. İnsan serum uyrcusu taze veya dondurulmuş, ZIKV enfekte hücre hatları ise şartlı ortam veya hücre lisatları içermelidir.
Son olarak, Aedes aegypti sivrisinekler için, taze ya da dondurulmuş tüm leşler kullanın. Buzdaki donmuş sivrisinek leşlerini eritin. PBS 100 mikrolitre bireysel bir sivrisinek yerleştirin.
P10 pipet ucu kullanarak sivrisinek 10 kez ezmek ve ham bir sivrisinek lysate oluşturmak için homojenize. Kısaca herhangi bir enkaz pelet ham lysate santrifüj ve aşağı RT-LAMP analizi için supernatant kullanın. Başlamak için, teknoloji protokolünde tablo üç anahat olarak, kullanılacak her astar için buz üzerinde bir RT-LAMP ana karışım reaksiyonu hazırlayın.
Girdap her örnek iyi karışık olduğundan emin olmak için. Sonra kısa bir süre ses kaybını önlemek için aşağı spin. Her reaksiyon için, pipet 23.0 rt-LAMP ana karışımı mikrolitre 200 mikrolitre PCR tüp içine.
Daha sonra, toplam hacmi 25,0 mikrolitreye çıkarmak için iki mikrolitre numune ekleyin. Negatif kontrol için moleküler sınıf su kullanın ve pozitif bir kontrol içerdiğinden emin olun. İsteğe bağlı olarak, teknoloji protokolünde belirtildiği gibi, dang virüsü gibi ilgili bir arbovirüs bir özgüllük kontrol reaksiyonu içerir.
Isı bloğu, su banyosu veya termocycler kullanarak numuneleri 61 derecede 30 dakika ısıtın. Bundan sonra, polimeraz devre dışı bırakmak için 10 dakika boyunca 80 derece santigrat ısı artırın. RT-LAMP çözümlemesi ayrı bir kapalı alanda gerçekleştirin.
Floresan nükleik asit boyasını TAE tamponunda 1'den 10'a seyreltin. RT-LAMP reaksiyonunun 12 micorlitresine floresan nükleik asit boya çözeltisinin iki mikorlitresini ekleyin. Rt-LAMP reaksiyonlarını bir renk değişikliğinin varlığını arayarak görsel olarak değerlendirin.
İsteğe bağlı olarak beyaz bir arka plan üzerinde RT-LAMP reaksiyonlarının fotoğraflarını çekmek için bir kamera kullanın. Daha sonra, floresan rt-LAMP ürünlerinin varlığını doğrulamak için 302 nanometre UV ışığı altında örnekleri yerleştirin. Sonucun fotoğrafını çekmek için kamera kullanın.
Elektroforez yapmaya başlamak için 1x TAE tamponuna %2 agarose jel dökün ve görselleştirme için nükleik asit lekesi dökün. Moleküler ağırlıkları karşılaştırmak için ilk şeritte bir DNA merdiveni beş mikrolitre ekleyin. Her RT-LAMP reaksiyonu için 13 mikrolitre RT-LAMP reaksiyon karışımını iki mikrolitre DNA yükleme boyasıyla karıştırın.
Bu 15 mikrolitre karışımı yükleyin. Jeli 90 voltta 90 dakika veya bantlar ayrılana kadar çalıştırın. 302 nanometre UV ışıklı bir görüntü.
Bittiğinde, RT-LAMP reaksiyonlarını çift mühürlü torbalara atın. Bu çalışmada RT-LAMP reaksiyonlarını analiz etmek için üç farklı yöntem kullanılmıştır. Floresan nükleik asit boyası kullanırken pozitif reaksiyonlar sarı-yeşil renkte olurken, negatif reaksiyonlar turuncu görünür.
Bu boya aynı zamanda numuneler UV ışığı yla heyecanlandığında floresan sinyalle sonuçlanır. Son olarak, RT-LAMP reaksiyonları bir agarose jel üzerinde çalıştırılabilir. Pozitif RT-LAMP reaksiyonları bantlama deseni olurken, negatif reaksiyonların DNA bandı olmayacaktır.
Bu yöntemler ZIKV RT-LAMP reaksiyonunun özgüllüğünü göstermek için kullanılır. Sadece ZIKV moleküler kontrolünde rt-LAMP reaksiyonu pozitif. Ayrıca ZIKV enfeksiyonu olduğu bilinen bir hastanın hem idrarında hem de serumunda ZIKV saptanırken, ZIKV enfeksiyonu olmayan asemptomatik kontrol hastalarında görülmez.
Örnekler daha sonra insan 18S rRNA için test edilir. Sadece hastalardan alınan örneklerin 18S rRNA pozitif olduğu görülmektedir. Sivrisinek örnekleri benzer şekilde ZIKV veya RT-LAMP kalite kontrol AEDAE için test edilebilir.
ZikV ve ZIKV ile enfekte olan sivrisineğin sadece pozitif moleküler kontrolüzikv için pozitif olarak görülmektedir. Ancak tüm sivrisinekler RT-LAMP ile AEDAE için pozitif. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa 30 dakika altında yapılabilir.
RT-LAMP reaksiyonlarının yanlış pozitif reaksiyonlara yatkın olduğunu unutmamak önemlidir. Önleme adımları reaksiyonlarda termobile urasil DNA glikozilaz kullanarak, yanal bir iş akışı kullanarak, ayrı bir alanda analiz yapma ve zaman sonrası amplifikasyon tüpleri açık azaltılması içerir. Bu yordamı takiben, örnekte virüsün kaç kopya veya diğer hedefler olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi başka yöntemler de yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, Zika virüsü ve insan idrar ve serum hedef kontrolleri tespit etmek için RT-LAMP nasıl kullanılacağı nı iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, yanı sıra sivrisinek. Zika virüsü ve nükleik asit lekesi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Zika virüsü enfeksiyonunun konjenital anomalilerle ilişkisi göz önüne alındığında, hamile, gebe kalmaya çalışan kadınlar veya bu kadınların partnerleri, laboratuvarda Zika virüsüne maruz kalmalarını önemli ölçüde en aza indirmelidir.
