此方法可以快速确定样品是否含有寨卡病毒。这对于孕妇、试图怀孕的夫妇或监测有寨卡感染风险的当地蚊子种群非常有用。该技术的主要优点是，它快速、简单，不需要昂贵的设备，并且无需RNA隔离步骤即可完成。
该技术的影响延伸到寨卡感染的诊断，因为怀孕期间的感染与流产、死产和其他严重的先天性神经性先天缺陷有关。虽然这种方法可以提供对寨卡的洞察，但它也可以通过使用病毒特异性底法应用于其他传染病，如登革热、基孔肯雅病毒或西尼罗河病毒。首先，将分子级水中的每个RT-LAMP底图重新构成100微摩尔的最终浓度。
简要涡流底解，以确保溶液是均匀的。以最高速度离心约五秒钟，以收集底转溶液。然后准备一个 10x RT-LAMP 底像组合，如技术协议表二中所述。
短暂涡流，确保均匀性。并在最大速度下短暂离心，以避免任何损失。将底像存放在零下20摄氏度的高温下，避免任何冻结循环。
对于人体尿液样本，使用新鲜尿液、冷冻尿液或防腐剂。使用前在冰上解冻任何冷冻样品。人类血清样本应新鲜或冷冻，而ZIKV感染的细胞系应含有条件介质或细胞酸盐。
最后，对于伊蚊，使用整个尸体，无论是新鲜或冷冻。在冰上解冻任何冷冻蚊子尸体。将单个蚊子放在 100 微升 PBS 中。
使用P10移液器尖端粉碎蚊子10次，并均匀化它，以产生一个粗糙的蚊子的lysate。简要地将粗液分离成颗粒任何碎屑，并使用上流液进行下游RT-LAMP分析。首先，为要使用的每个底像准备的RT-LAMP主混合反应，如技术协议中的表三所示。
漩涡每个样品，以确保它很好地混合。然后简要旋转它们，以防止体积丢失。对于每次反应，RT-LAMP 主液的移液器 23.0 微升混合成 200 微升 PCR 管。
然后，添加两个微升样品，使总体积达到 25.0 微升。使用分子级水进行负对，并确保包括阳性对照。可选地，包括相关阿尔博病毒（如登革热病毒）的特异性控制反应，如技术协议中所述。
使用热块、水浴或热循环器，在 61 摄氏度下加热样品 30 分钟。在此之后，将热量增加至80摄氏度10分钟，以加热停用聚合酶。在单独的封闭空间中执行 RT-LAMP 分析。
在 TAE 缓冲液中稀释荧光核酸染料一至十。在RT-LAMP反应的12个微升器中加入荧光核酸染料溶液的两个微升器。通过查找颜色变化的存在，直观地评估 RT-LAMP 反应。
可选使用相机在白色背景上拍摄 RT-LAMP 反应的照片。接下来，将样品放在302纳米的紫外光下，通过荧光确认RT-LAMP产品的存在。使用相机拍摄结果。
开始执行电泳将 2% 的 agarose 凝胶倒入 1x TAE 缓冲液中，并含有核酸污渍，用于可视化。在第一条通道中加入五个微升的DNA梯子，比较分子量。对于每个RT-LAMP反应，将13微升RT-LAMP反应混合物与两个微升DNA加载染料混合。
加载这 15 微升混合物。以 90 伏运行凝胶 90 分钟，或直到带子分离。具有 302 纳米紫外光的图像。
完成后，将RT-LAMP反应处理在双密封袋中。本研究采用三种不同的方法分析RT-LAMP反应。使用荧光核酸染料时，阳性反应呈黄绿色，而负反应呈橙色。
当样品被紫外线点燃时，这种染料也会产生荧光信号。最后，RT-LAMP反应可以在阿加罗斯凝胶上耗尽。正RT-LAMP反应将有一个带状模式，而负反应将没有DNA带。
这些方法用于演示ZIKVRT-LAMP反应的特异性。只有ZIKV分子控制具有阳性的RT-LAMP反应。此外，虽然ZIKV在已知ZIKV感染患者的尿液和血清中均被检测到，但在没有ZIKV感染的无症状控制患者中却未发现ZIKV。
然后对样品进行人体18S rRNA测试。只有从患者身上采集的样本对18S rRNA呈阳性反应。蚊子样本也可以对 ZIKV 或 RT-LAMP 质量控制 AEDAE 进行类似测试。
只有ZIKV和感染ZIKV的蚊子的阳性分子对照对ZIKV呈阳性。然而， 所有的蚊子都积极为 Aedae 由 Rt - lamp 。一旦掌握，这项技术可以在30分钟内完成，如果它执行得当。
重要的是要记住，RT-LAMP反应容易出现误报反应。预防步骤包括在反应中使用热实验室DNA糖基酶，使用横向工作流程，在单独的空间中执行分析，以及减少扩增管打开后的时间。按照此过程，可以执行其他方法（如 QPCR）以回答其他问题，例如示例中存在多少个副本的病毒或其他目标。
看完这段视频后，您应该对如何使用RT-LAMP检测寨卡病毒和人体尿液和血清以及蚊子中的目标控制有一个很好的理解。不要忘记，使用寨卡病毒和核酸污渍可能极其危险，在执行此过程时应始终采取戴手套等预防措施。鉴于寨卡病毒感染与先天性异常有关，怀孕、试图怀孕的妇女或这些妇女的伴侣应显著减少她们在实验室中感染寨卡病毒的风险。
