이 방법은 샘플에 Zika 바이러스가 포함되어 있는지 신속하게 확인할 수 있습니다. 이것은 임신 한 여성, 임신을 시도하는 커플, 또는 Zika 감염의 위험이있는 지역 모기 집단의 감시에 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 쉽고 고가의 장비가 필요하지 않으며 RNA 격리 단계없이 수행 할 수 있다는 것입니다.
임신 도중 감염은 유산, 사산 및 그밖 가혹한 선천적인, 신경학적 출생 결함에 연결되기 때문에 이 기술의 연루는 Zika 감염의 진단으로 확장합니다. 이 방법은 Zika에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 바이러스 별 프라이머를 사용하여 뎅기열, 치쿤구냐 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 다른 전염병에도 적용 될 수 있습니다. 시작하려면 분자 등급 의 물에 있는 각 RT-LAMP 프라이머를 100 마이크로몰라의 최종 농도로 재구성합니다.
용액이 균일한지 확인하기 위해 프라이머 솔루션을 간략하게 소용돌이시다. 프라이머 솔루션을 수집하기 위해 최대 속도로 약 5초 동안 원심분리기. 그런 다음 기술 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 10x RT-LAMP 프라이머 믹스를 준비합니다.
균질성을 보장하기 위해 잠시 소용돌이. 그리고 손실을 피하기 위해 최대 속도로 원심 분리기. 프리머를 섭씨 영하 20도까지 저장하여 사용 사이에 동결 해동 주기를 피하십시오.
인간의 소변 샘플에 대 한, 신선한 소변을 사용 하 여, 냉동 소변 또는 방부제에 소변. 사용하기 전에 얼음에 얼어 붙은 샘플을 해동하십시오. 인간 혈청 샘플은 신선하거나 냉동되어야 하며 ZIKV 감염된 세포주에는 조건부 된 미디어 또는 세포 리스가 포함되어야합니다.
마지막으로, Aedes aegypti 모기에 대 한, 전체 시체를 사용 하 여, 신선한 또는 냉동. 얼음 위에 얼어 붙은 모기 시체를 해동하십시오. PBS의 100 마이크로 리터에 개별 모기를 놓습니다.
P10 파이펫 팁을 사용하여 모기를 10번 분쇄하고 균질화하여 조잡한 모기 용해를 만듭니다. 원유 리세스를 간단히 원심분리하여 이물질을 펠렛하고 상류 RT-LAMP 분석을 위해 상퍼를 사용합니다. 시작하려면 기술 프로토콜의 표 3에 의해 윤곽선으로 사용할 각 프라이머 세트에 대한 얼음에 RT-LAMP 마스터 믹스 반응을 준비합니다.
각 샘플을 소용돌이가 잘 혼합되었는지 확인합니다. 그런 다음 볼륨 손실을 방지하기 위해 잠시 아래로 회전합니다. 각 반응에 대해 RT-LAMP 마스터의 파이펫 23.0 마이크로리터가 200 마이크로리터 PCR 튜브로 혼합됩니다.
그런 다음 두 개의 마이크로리터를 추가하여 총 부피를 25.0 마이크로리터로 가져옵니다. 음의 대조를 위해 분자 등급의 물을 사용하고 양수 조절을 포함하십시오. 선택적으로, 기술의 프로토콜에 설명된 바와 같이 뎅기열 바이러스와 같은 관련 arbovirus의 특이성 제어 반응을 포함한다.
열 블록, 수조 또는 열 순환기는 샘플을 섭씨 61도에서 30 분 동안 가열합니다. 그 후, 열을 10분 동안 섭씨 80도로 늘려 중합체를 비활성화합니다. 별도의 밀폐된 공간에서 RT-LAMP 분석을 수행합니다.
TAE 완충에서 형광 핵산 염료를 1~10개 희석시 희석한다. 형광 핵산 염료 용액의 2개의 미소리터를 RT-LAMP 반응의 12개 미소리터에 추가합니다. 색상 변경의 존재를 찾아 서 시각적으로 RT-LAMP 반응을 평가합니다.
선택적으로 카메라를 사용하여 흰색 배경에서 RT-LAMP 반응 사진을 찍습니다. 다음으로, 302 나노미터 UV 빛 아래에 샘플을 배치하여 형광에 의한 RT-LAMP 제품의 존재를 확인합니다. 카메라를 사용하여 결과 사진을 찍습니다.
전기포고증을 수행하기 시작하려면 1x TAE 완충제에 2%아가로즈 젤을 부어 핵산 얼룩을 가비시화한다. 분자량을 비교하기 위해 첫 번째 차선에 DNA 사다리의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 각 RT-LAMP 반응에 대해, DNA 로딩 염료의 두 마이크로 리터와 RT-LAMP 반응 혼합물의 13 마이크로 리터를 혼합.
이 15 마이크로 리터 혼합물을 로드합니다. 90볼트에서 90분 간 또는 밴드가 분리될 때까지 젤을 실행합니다. 302 나노미터 UV 광이 있는 이미지입니다.
완료되면 RT-LAMP 반응을 이중 밀봉 된 가방에 폐기하십시오. 이 연구에서는 RT-LAMP 반응을 분석하기 위해 세 가지 다른 방법을 활용합니다. 형광 핵산 염료 양성 반응을 사용할 때 긍정적 인 반응은 색으로 황색 - 녹색이되고 부정적인 반응은 주황색으로 나타납니다.
이 염료는 또한 샘플이 UV 빛에 의해 흥분될 때 형광 신호를 초래합니다. 마지막으로, RT-LAMP 반응은 아가로즈 젤에서 소진될 수 있다. 긍정적 인 RT-LAMP 반응은 밴딩 패턴을 가지지만 부정적인 반응은 DNA 밴드가 없습니다.
이러한 방법은 ZIKV RT-LAMP 반응의 특이성을 입증하기 위해 사용된다. ZIKV 분자 제어만이 양성 RT-LAMP 반응을 가한다. 더욱이, ZIKV는 알려진 ZIKV 감염을 가진 환자의 소변과 혈청 둘 다에서 검출되는 동안, ZIKV 감염 없이 무증상 통제 환자에서 볼 수 없습니다.
샘플은 인간 18S rRNA를 위해 시험됩니다. 환자에서 채취한 샘플만이 18S rRNA에 대해 양성으로 보입니다. 모기 샘플은 ZIKV 또는 RT-LAMP 품질 관리 AEDAE를 위해 유사하게 테스트될 수 있습니다.
ZIKV와 ZIKV에 감염된 모기에 대한 양성 분자 제어만이 ZIKV에 대해 양성으로 보입니다. 그러나 모든 모기는 RT-LAMP에 의해 AEDAE에 대한 긍정적이다. 일단 마스터되면, 제대로 수행되는 경우이 기술은 30 분 이내에 수행 할 수 있습니다.
RT-LAMP 반응은 거짓 긍정 반응에 경향이 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 예방 단계에는 반응에 열람실 우라실 DNA 글리코슬라아제 사용, 측면 워크플로우 사용, 별도의 공간에서 분석 수행, 노출 후 증폭 튜브가 열린 시간 단축 등이 포함된다. 이 절차에 따라 QPCR과 같은 다른 방법은 샘플에 존재하는 바이러스 또는 기타 표적의 사본 수와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.
이 비디오를 시청 한 후, 당신은 Zika 바이러스를 감지하기 위해 RT-LAMP를 사용하는 방법의 좋은 이해가 있어야합니다 인간의 소변과 혈청에 제어를 대상으로, 뿐만 아니라 모기. Zika 바이러스와 핵산 얼룩으로 일하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오, 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다. 선천적인 이상Zika 바이러스 감염의 협회를 감안할 때, 임신한 여자, 임신을 시도하는, 또는 이 여자의 파트너는, Zika 바이러스에 그들의 실험실 노출을 현저하게 최소화해야 합니다.
