この方法は、サンプルにジカウイルスが含まれているかどうかを迅速に判断できます。これは、妊娠中の女性、妊娠しようとしているカップル、またはジカ感染の危険にさらされている地元の蚊集団の監視に役立ちます。この技術の主な利点は、高速で簡単で、高価な機器を必要とせず、RNA分離ステップなしで行うことができることです。
妊娠中の感染は流産、死産、その他の重度の先天性神経学的出生時欠損に関連しているため、この技術の意味合いはジカ感染の診断にまで及ぶ。この方法はジカに関する洞察を提供することができますが、ウイルス特異的プライマーを使用してデング熱、チクングニア、またはウェストナイルウイルスなどの他の感染症にも適用できます。まず、各RT-LAMPプライマーを分子グレード水に再構成し、最終濃度の100マイクロモルにします。
溶液が均一であることを保証するためにプライマー溶液を簡単に渦液。遠心分離機は、プライマー溶液を収集するために最高速度で約5秒間。その後、技術のプロトコルの表2に概説されているように、10倍のRT-LAMPプライマーミックスを準備します。
均質性を確保するために簡単に渦を起分。そして、任意の損失を避けるために、最高速度で一時的に遠心分離機。使用の間にマイナス20度でプライマーを保管し、フリーズ解凍サイクルを避けます。
ヒトの尿サンプルの場合、新鮮な尿、凍結した尿または尿を防腐剤に使用してください。使用前に氷上の凍結サンプルを解凍してください。ヒト血清サンプルは新鮮または凍結する必要があり、ZIKV感染細胞株には条件付き培地または細胞ライセートのいずれかが含まれている必要があります。
最後に、Aedes aegypti蚊のために、新鮮または凍結のいずれか、全体の死体を使用してください。氷の上の凍った蚊の死骸を解凍します。PBSの100マイクロリットルに個々の蚊を置きます。
P10ピペットチップを使用して蚊を10回粉砕し、均質化して粗い蚊のライゼートを作ります。粗なライゼートを簡単に遠心分離して、残骸をペレット化し、上清を下流のRT-LAMP分析に使用します。まず、技術のプロトコルの表3の概要として、使用されるプライマーセットごとに氷上でRT-LAMPマスターミックス反応を準備します。
各サンプルが十分に混合されていることを確認するために渦を巻く。その後、ボリュームの損失を防ぐためにそれらを簡単に回転させます。各反応に対して、200マイクロリットルのPCRチューブに200マイクロリットルのPCRチューブに混合するRT-LAMPマスターのピペット23.0マイクロリットル。
次に、サンプルを2マイクロリットル加え、総容積を25.0マイクロリットルにします。負のコントロールには分子グレードの水を使用し、正のコントロールを含むようにしてください。必要に応じて、技術のプロトコルで概説されているように、デング熱ウイルスなどの関連するアルボウイルスの特異性制御反応を含める。
ヒートブロック、水浴、またはサーモサイクラーを使用して、サンプルを摂氏61度で30分間加熱します。この後、ポリメラーゼを加熱非活性化するために10分間80°Cに加熱します。RT-LAMP 解析を別の密閉空間で実行します。
TAEバッファーで蛍光核酸染料を1~10個希釈します。RT-LAMP反応の12ミコルリットルに蛍光核酸色素溶液の2つのミコーリットルを加えます。色の変化の存在を探すことによって目視でRT-LAMP反応を評価する。
オプションでカメラを使用して、白い背景にRT-LAMP反応の写真を撮ります。次に、302ナノメートルのUV光下にサンプルを置き、蛍光によるRT-LAMP製品の存在を確認します。カメラを使用して結果を撮影します。
電気泳動の実施を開始するには、可視化のための核酸染色を用いて1x TAEバッファーに2%アガロースゲルを注ぎます。最初のレーンにDNAラダーを5マイクロリットル加えて分子量を比較します。RT-LAMP反応ごとに、RT-LAMP反応混合物の13マイクロリットルを2マイクロリットルのDNAローディング色素と混合します。
この15マイクロリットルの混合物をロードします。90ボルトで90分、またはバンドが分離されるまでゲルを実行します。302ナノメートルのUV光を持つ画像。
終了したら、RT-LAMP反応を二重密閉袋に入れなさい。本研究では、RT-LAMP反応を分析するために3つの異なる方法が利用される。蛍光核酸色素を使用すると、正の反応は黄色緑色になり、ネガティブ反応はオレンジ色に見えます。
この色素は、サンプルがUV光によって励起されると蛍光シグナルを生じます。最後に、RT-LAMP反応はアガロースゲルで使い果たすことができます。正のRT-LAMP反応はバンディングパターンを持ち、否定的な反応はDNAバンドを持たない。
これらの方法は、ZIKV RT-LAMP反応の特異性を実証するために使用される。ZIKV分子制御のみが正のRT-LAMP反応を有する。さらに、公知のZIKV感染を有する患者の尿および血清の両方でZIKVが検出される一方で、ZIKV感染のない無症候性対照患者では見られない。
その後、サンプルをヒト18S rRNAについて試験する。患者から採取したサンプルのみが18S rRNAに対して陽性であることが分かる。蚊のサンプルはZIKVまたはRT-LAMP品質管理AEDAEのために同様にテストすることができる。
ZIKVとZIKVに感染した蚊の陽性分子制御のみがZIKVに陽性であると見られる。しかし、すべての蚊はRT-LAMPによってAEDAEにとって陽性です。一度習得すると、この技術は、それが正常に実行されている場合、30分以内に行うことができます。
RT-LAMP反応は偽陽性反応を起こしやすいことを覚えておくことが重要です。予防手順には、熱labileウラシルDNAグリコシラーゼを反応に使用すること、横型ワークフローを使用する、別の空間で分析を行う、および増幅後のチューブが開いている時間を短縮するが含まれる。この手順に従って、サンプルに存在するウイルスや他のターゲットのコピーの数など、追加の質問に答えるために QPCR のような他の方法を実行できます。
このビデオを見た後、あなたはジカウイルスを検出し、人間の尿や血清だけでなく、蚊のコントロールを標的にするRT-LAMPを使用する方法をよく理解する必要があります。ジカウイルスや核酸汚れで作業することは非常に危険であり、手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。ジカウイルス感染と先天性異常との関連を考えると、妊娠している女性、妊娠しようとしている女性、またはこれらの女性のパートナーは、ジカウイルスへの実験室への暴露を大幅に最小限に抑えるべきである。
