Büyük, çok hücreli yapıların incelenmesine olan ilginin artması, saydam organlar daki büyük yapıların üç boyutlu bir görselleştirme ve nicelleştirilmesine olanak sağlayan bu optik temizleme tekniğinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu protokol, dokuları üç boyutlu olarak araştırmak için basit, ucuz, kurulumu kolay ve kapsamlı bir araç sağlar. Bir hastalığın çok katmanlı doğası her zaman geleneksel iki boyutlu teknikler ile simüle edilemez.
Doku üç boyutlu analizi daha iyi teşhis ve hastalık izlemek için yardımcı olabilir. Bu yöntem böbrek dokusu ile sınırlı değildir ve herhangi bir normal ve hastalıklı doku uygulanabilir. Bu basit protokolü hayvan işleme bazı deneyime sahip herhangi bir bilim adamı için takip etmek kolaydır.
Kötü antikor etiketleme durumunda farklı antikorların test etmek ve ikincil antikor kontrolleri yapmak önemlidir. 1X PBS'de PBS ve %3.0 paraformaldehit içeren heparini el yazması talimatlara göre hazırlayarak ve çözümleri ayrı 50 mL plastik şırıngalara aktararak başlayın. Paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda hazırlanmalıdır.
El yazması talimatlara göre böbreği toplayın ve bolca kullanın. Sonra, kapsül kaldırmak ve bir mm kalınlığında koronal dilimler halinde böbrek kesti. Hazırlanan paraformaldehit çözeltisi ile böbrek dilimlerini 15 mL konik tüpe batırın.
Fiksasyon sonra, yatay bir rocker bir saat boyunca 1X yıkama tampon ile iki kez böbrek dilimi yıkayın ve daha sonra antijen alma ile devam edin. 500 mL'lik bir kabın içinde 300 mL 1X antijen inmaskeleme çözeltisini ısıtın. Daha sonra, ısıtılmış tampon geçirilebilir bir gömme kaset bir böbrek dilimi içine ve 92 ila 98 santigrat derece bir saat karıştırın.
Bu antijen alma adımı için sıcaklığı 92 ile 98 santigrat derece arasında sabit tutmak önemlidir. Daha sonra dilimi 10 mL 1X yıkama tamponuna %0,1 Triton X-100 ile aktarın ve bir gecede sallayın. Ertesi gün, dilimi 10 mL taze 1X yıkama tamponu yla iki kez bir saat yıkayın.
Normal antikor dilüent 500 mikrolitre birincil antikor seyreltin. Böbrek dilimini seyreltilmiş primer antikorda 4 gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe sallayın. Kuluçkadan sonra böbrek dilimini 10 mL 1X'lik bir gecede oda sıcaklığında yıkayın ve tamponu sekiz saat sonra bir kez değiştirin.
Normal antikor dilüent 500 mikrolitre ikincil antikorlar seyreltmek ve 37 santigrat derece dört gün boyunca böbrek dilimi ile kuluçka. Bu adımdan itibaren böbrek diliminin ışıktan korunması gerektiğini lütfen unutmayın. Sekonder antikorlarla kuluçkadan sonra böbrek dilimini 10 mL 1X yıkama tamponunu oda sıcaklığında bir gecede yıkayın.
Böbrek dilimini susuz leştirmek için, yüksek dereceli %100 etanolün beş mL'sine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca sallayın, bir saat sonra etanolünü yenileyin. Böbrek dilimini iki mL etil cinnamate'e batırın ve bir gecede hafifçe kayalayın. Doku görüntü hazır olduğunda, bir cam alt çanak içine etil cinnamate 600 ila 1000 mikrolitre ekleyin ve çanak içine böbrek dilimi aktarın.
Böbrek dilimi üzerine yuvarlak bir kapak fişi yerleştirin ve parafin film ile çanak mühür. Tabağı mikroskop görüntüleme platformuna yerleştirin ve el yazması talimatlara göre dokuyu görüntüleyin. Bu protokol böbrek dokusu üzerinde 3Boyutlu analizleri başarıyla gerçekleştirmek ve hücre fonksiyonlarını ve etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılmıştır.
Yöntem floresan muhabirin söndürülemelerine neden olabilir ancak diğer güçlü floresan proteinler sinyal söndürmeye karşı koyabilir. Abdominal aort profüzyonu antikor difüzyonu artırabilir. Bazı durumlarda, kötü antikor penetrasyonu yüzeysel bir sinyal ile sonuçlanır.
Bu yüksek konsantrasyonlarda veya antikor ikmali ile düzeltilebilir. İlgi antijeni böbrek vaskülatürde ifade edilirse intravasküler doğum düşünülmelidir. Ancak tübül epitel hücrelerinin apikal zarındaki proteinleri hedef alan antikorlar glomerüler filtrasyon bariyerini geçmez ve spesifik olmayan sinyallere neden olmaz.
Doku belirli bir hücre popülasyonunu tespit etmek veya tüm tübül segmentlerini görselleştirmek için antikorlarla etiketlenebilir. Ayrıca proteinlerin 3Boyutlu olarak kolokalizasyonu birden fazla antikor birleştirilerek elde edilebilir. Bu antikor etiketleme iyi böbrek profüzyonu ile geliştirilebilir hatırlamak önemlidir, antijen alma adımı kullanımı, ve yüksek antikor konsantrasyonu.
Bazı güçlü muhabir proteinler bu protokolü izleyerek floresan sinyalin söndürülmelerine karşı koyabilirler. Bunu test etmek için, antijen alma ve antikor etiketleme adımlarını atlayın. Bu teknik yapıların üç boyutlu doğasına saygı duyar ve araştırma için birçok yeni alan açar.
Geleneksel iki boyutlu analizle ilişkili gerekli varsayımları ve girişimleri ortadan kaldırır.
