Bu yöntem patolojik ve immünohistokimya anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı yeterince hızlı ve yüksek kalitede dijital medya üretir. Oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit bir üç-by-üç santimetre kung doku örneği sabitleme ile başlayın.
Ertesi gün, oda sıcaklığında artan etanol daldırma doku dehydrate, tedavi başına 20 dakika boyunca% 100 ksilen üç daldırma izledi. Son ksilen daldırma sonra, 30 dakika boyunca 63 derece santigrat parafin doku yerleştirin, taze 63 derece santigrat parafin ikinci bir 45 dakikalık daldırma takip, sonra son bir saatlik kuluçka için bir kez daha parafin değiştirin. Parafin soğuduğunda, parafin gömülü doku örneğinin beş mikrometre kalınlığındaki bölümlerini elde etmek için döner bir mikrotom kullanın ve mililitre başına 20 mikrogramlık poli-L-l-lizin kaplı slaytların kesitlerini yakalayın.
Dewaxing için, iki saat boyunca 65 derece santigrat fırında slaytlar yerleştirin, dimetilbenzen daldırma ardından 15 dakika ve 15 dakika boyunca% 100 ksilen içinde ıslatma, sonra azalan bir etanol daldırma serisi slaytlar rehydrating. Antijen onarımı için, bir antijen onarım kutusuna slaytlar yerleştirin ve kutuya sitrik asit onarım sıvı 300 mililitre ekleyin. Isı iki dakika boyunca yüksek güçte bir mikrodalga fırında kutu, altı dakika kaynama sürdürmek için düşük güçte ısıtma izledi.
Slaytlar oda sıcaklığına kadar soğuduğunda, doku örneklerini oda sıcaklığında döner çalkalayıcıda üç beş dakikalık 0.01 molar PBS yıkar ile yıkayın. Endojen peroksidaz ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında ıslak bir kutu içinde 30 dakika boyunca çift distile suda% 3 hidrojen peroksit ile slaytlar inkübed. Kuluçka sonunda, slaytları gösterildiği gibi yıkayın ve her bölümdeki nonspesifik bağlanmayı 100 mikrolitre 10 mikrolitre 10 keçi serumu ile 39 dakika boyunca 37 santigrat derecede takın.
Daha sonra, bir gecede slayt başına 100 mikrolitre anti-ZWINT antikor içeren dokuları etiketle, ardından 0,01 molar PBS'de üç yıkayArak etiketlendi. Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derece 30 dakika için uygun bir ikincil antikor ile slaytlar kuluçka, üç 0.01 molar PBS yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, 10 dakika boyunca taze DAB 300 mikrolitre slaytlar ekleyin, oda sıcaklığında musluk suyu ile 10 saniyelik yıkama izledi.
Sayaçlar oda sıcaklığında iki dakika hematoksilin boyama çözeltisi ile dokuları lekeler, ardından musluk suyunda 15 dakika yıkar, ardından artan etanol daldırmadoku tekrar dehydrate, oda sıcaklığında ksilen iki 15 dakikalık daldırma takip. Son %100 etanol daldırma sonra, nötr diş eti çözeltisi% 5 ksilen 15 mikrolitre ile bölümleri monte ve bir kapak camı ile her doku örneğini kaplayın. Bölümlerin otomatik olarak tam slayt taraması için, önce doku örneklerini kurutmak için slaytların oda sıcaklığında 12 saat kurumasını bekleyin.
Ardından, otomatik tüm slayt tarayıcısında Brightfield'ı el ile seçin ve manuel tarama arabirimine girin. Slaytların adını gözden geçirin ve görüntüler için bir depolama yolu seçin. Tarama alanını ayarlayın ve Kullanıcı Ayarlı Eşikler seçeneğini kullanarak tarama örneklerini seçin.
Eşik 200 mikrometre tarama alanı genişleme değeri ile yaklaşık 50 olduğunu. Tarama lı odak değerini ayarlayın ve Otomatik Odaklama ve Tek Katman modunu seçin, ardından slaytları iş istasyonuna yükleyin ve otomatik taramayı başlatın. Tüm slaytlar tarandığında, görüntüleri daha sonraki çözümlemeiçin kaydedin.
Akciğer dokusu bölümlerinin görüntülerini analiz etmek için histopatolojik görüntü analiz yazılımını açın ve tarama verileriyle dosyayı açmak için Yerel Bilgisayar'ı seçin. Uygun yakınlaştırma düzeyini seçin ve rengi en uygun karşıtlaşmaya ayarlamak için Renk Ayarlama'yı kullanın, ardından her görüntüde ilgi çekici bölgeleri daire içine alın ve adlayın. Ardından, eklentiler altında QC'yi seçin. Senaryo Oluşturucu açılır.
Yoğunluk Quant'ı seçin ve algılama çubuğunu ayarlayın. Daire içine alınan alanların boyama yoğunluğu orijinal görüntülere benzeyene kadar puan düzeylerini ayarlayın ve modeli yeni bir dosya olarak saklayın ve adlandırın, ardından modeli diğer slaytlara uygulayın ve yazılımın her görüntüdeki ilgi alanlarıiçin APE puanını otomatik olarak hesaplamasını sağlamak için Seçili Ek Açıklama'yı seçin. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri örneklerinden tümörün akciğer dokusu bölümlerinin ve komşu tümör dışı dokuların tam slaytlı dijital taraması, yüksek kalitede dijital görüntüler üretmektedir.
Bu tip akciğer kanseri örneklerinden hesaplanan APE skorları tipik olarak komşu kanser dışı dokular için belirlenenlerden önemli ölçüde daha yüksektir. Buna ek olarak, skuamöz hücreli karsinom doku kesitlerinde ZWINT ekspresyon düzeyleri sıklıkla abnokarsinom doku örneklerinde ölçülenlere göre anlamlı olarak daha yüksek olarak belirlenmiştir. Bu işlemi denerken patolojik tarama yaparken tümör veya tümör bölgelerinin yüksek kalitede hazırlanmasını unutmamak önemlidir.
Bu işlemden sonra ek soruları cevaplamak için mikroskopinin diğer yöntemleri de yapılabilir. Patolojik tarama için ne de farklı bir yöntem. Bu teknikten sonra patolojik tarama alanında araştırmacıların araştırma amaçlı dijital tanıyı keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken maske gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
