Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la patología y la inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta técnica es que es lo suficientemente rápido y que produce medios digitales con alta calidad. Comience por fijar una muestra de tejido kung de tres por tres centímetros en 4%paraformaldehído durante 24 horas a temperatura ambiente.
Al día siguiente, deshidratar el tejido en inmersiones ascendentes de etanol a temperatura ambiente, seguidas de tres inmersiones en 100% xileno durante 20 minutos por tratamiento. Después de la última inmersión de xileno, coloque el tejido en parafina Celsius de 63 grados durante 30 minutos, seguido de una segunda inmersión de 45 minutos en parafina fresca de 63 grados Celsius, luego cambie la parafina una vez más para una incubación final de una hora. Cuando la parafina se haya enfriado, utilice un microtoma rotativo para adquirir secciones de cinco micrómetros de espesor de la muestra de tejido incrustado en parafina, capturando las secciones en diapositivas recubiertas de poli-L-lisina de 20 microgramos por mililitro.
Para el desenrachamiento, coloque los portaobjetos en un horno Celsius de 65 grados durante dos horas, seguido de la inmersión en dimetilbenceno durante 15 minutos y remojando en 100% xileno durante 15 minutos, luego rehidratando los portaobjetos en una serie de inmersión de etanol descendente. Para la reparación de antígenos, coloque los portaobjetos en una caja de reparación de antígenos y agregue 300 mililitros de líquido reparador de ácido cítrico a la caja. Calienta la caja en un horno microondas a alta potencia durante dos minutos, seguido de calentamiento a baja potencia para mantener la ebullición durante seis minutos.
Cuando los portaobjetos se hayan enfriado a temperatura ambiente, lave las muestras de tejido con tres lavados molares PBS de cinco minutos y 0,01 en una coctelera giratoria a temperatura ambiente. Para eliminar la peroxidasa endógena, incubar los toboganes con 3% de peróxido de hidrógeno en agua doble destilada durante 30 minutos en una caja húmeda a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los portaobjetos como se ha demostrado y enchufa cualquier unión inespecífica en cada sección con 100 microlitros de 10% de suero de cabra durante 39 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, etiquete los tejidos con 100 microlitros de anticuerpo anti-ZWINT por diapositiva a cuatro grados Celsius durante la noche, seguido de tres lavados en 0.01 MOLar PBS. Después del último lavado, incubar los portaobjetos con un anticuerpo secundario adecuado durante 30 minutos a 37 grados Centígrados, seguido de tres lavados de PBS molares 0,01. Después del último lavado, agregue los portaobjetos a 300 microlitros de DAB fresco durante 10 minutos, seguido de un lavado de 10 segundos con agua del grifo a temperatura ambiente.
Los contadores tiñen los tejidos con solución de tinción de hematoxilina durante dos minutos a temperatura ambiente, seguidos de lavar en agua del grifo durante 15 minutos, luego deshidratar el tejido de nuevo en inmersiones ascendentes de etanol, seguidos de dos inmersiones de 15 minutos en xileno a temperatura ambiente. Después de la última inmersión 100%etanol, monte las secciones con 15 microlitros de una solución de goma neutra al 5% del xileno y cubra cada muestra de tejido con un vidrio de cubierta. Para el escaneo automático de diapositivas integrales de las secciones, primero deje que las diapositivas se sequen a temperatura ambiente durante 12 horas para desecar las muestras de tejido.
A continuación, en el escáner automático de deslizamiento completo, seleccione Brightfield manualmente e introduzca la interfaz de escaneo manual. Revise el nombre de las diapositivas y seleccione una ruta de almacenamiento para las imágenes. Establezca el área de escaneado y seleccione las muestras de escaneado mediante la opción Umbrales de conjunto de usuarios.
El umbral es de unos 50 con un valor de expansión de área de escaneo de 200 micrómetros. Establezca el valor de enfoque de escaneado y seleccione el modo Enfoque automático y Capa única, luego cargue las diapositivas en la estación de trabajo e inicie el escaneo automático. Cuando se hayan escaneado todas las diapositivas, guarde las imágenes para su análisis posterior.
Para analizar las imágenes de las secciones del tejido pulmonar, abra el software de análisis de imágenes histopatológico y seleccione Equipo local para abrir el archivo con los datos de escaneado. Seleccione el nivel de zoom adecuado y utilice Alternar ajuste de color para establecer el color en el contraste óptimo, luego circule y asigne un nombre a las regiones de interés en cada imagen. A continuación, en plugins, seleccione QC. Aparecerá el Generador de escenarios.
Seleccione Quant de densidad y ajuste la barra de detección. Ajuste los niveles de puntuación hasta que la intensidad de tinción de las áreas en círculo sea similar a la de las imágenes originales, y almacene y asigne el nombre al modelo como un archivo nuevo, luego aplique el modelo a otras diapositivas y seleccione Anotación seleccionada para permitir que el software calcule automáticamente la puntuación APE para las regiones de interés en cada imagen. La exploración digital de deslizamiento completo de secciones de tejido pulmonar del tumor y tejidos no tumorales adyacentes a partir de muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas produce imágenes digitales de alta calidad.
Las puntuaciones de APE calculadas a partir de estos tipos de muestras de cáncer de pulmón suelen ser significativamente más altas que las determinadas para los tejidos adyacentes no cancerosos. Además, los niveles de expresión de ZWINT en las secciones del tejido del carcinoma de células escamosas se determinan con frecuencia para ser significativamente más altos que los medidos en muestras de tejido de abnocarcinoma. Al intentar este procedimiento, es importante recordar prepararse con alta calidad del tumor o áreas tumorales durante la realización de exploraciones patológicas.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos de la microscopía para responder preguntas adicionales. Ni el método ni el método diferente para el escaneo patológico. Después de esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del escaneo patológico exploraran el diagnóstico digital con el propósito de la investigación.
No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como máscaras durante la realización de este procedimiento.
