Bu makalede, üç boyutlu, çok hücreli organ kültürü model sisteminde yaralamayı nitelemede kullanılan basit bir yöntem tanımlanmıştır. Biz domuz gözleri kullanarak bunu, ama gözleri aşina olmasa bile, bu titret yapabilirsiniz. Genel bir bakış olarak, domuz gözleri aldık, küreleri kestik, korneada epitelden geçen dairesel bir yara yaptık ve stromanın yaklaşık üçte biri.
Korneayı kesip, bir Agar tabanına monte edip, bu yapıyı kuvöze yerleştiriyoruz. Doku korneada bir yara izi oluşturarak dolacak. Herhangi bir büyüme faktörü, hatta serum eklemek gerekmez.
Bu serumsuz ortamda yapılır. Bu korneada yapılmasına rağmen, genel olarak fibrotik iyileşme için bir model sistemi olarak kullanılabilir. Yara izi sırasında aktive olan hücresel yolların çoğu sistemler arasında benzer olduğu gibi.
Bir biyogüvenlik başlık olarak, bir etanol temizlenmiş doğrama tahtası üzerinde kapak tan küre kaldırmak için düz kenar cerrahi bıçak kullanın, ve her gözaşırı yağ dokusu kaldırmak. Temizlenmiş küreyi posteriora'da forcep'lerle tutarak gözü hemen PBS'ye daldırın ve ardından %10 iyotta üç hızlı düşüş ve PBS'de iki hızlı dalış yapın. Sonra kornea temas etmeden gergin bir kornea yüzeyine ulaşmak için yeterli basınç ile sarmak için temiz bir laboratuvar dokusu ile çevreye doğru göz sarın.
Altı milimetrelik bir trephine kullanarak, tüm kornea boyunca tam kalınlıkta yara yapmadan korneanın merkezinde ön stroma epitel nüfuz, ve yara derinleştirmek için ışık basıncı uygularken trephine 180 derece saat yönünde ve saat yönünün tersine beş kez döndürmek. Yara, bir doku flebininin forsepsle kaldırılmasına izin verecek kadar derin olduğunda, yara marjı içindeki ön korneayı kaldırmaya devam ederken kapağı dünyaya paralel kesmek için cerrahi bir bıçak kullanın. Flepin tamamı çıkarıldığında korneanın merkezinde dairesel bir yara bulunmalıdır.
Kornea hasat laboratuvar dokusu ile göz kavramak ve limbus ve doku toplama dahil kornea kenarından bir milimetre uzaklıkta küçük bir kesi yapmak için bir cerrahi bıçak kullanın. Küçük, keskin makas kullanarak ince limbus tutmak için kornea boyunca bir milimetre marjı tutarak dünya çapında kesi devam ediyor. Sonra kornea yerleştirin, yara tarafı aşağı, bir 60 milimetre, ya da PBS bir mililitre içeren 100 milimetre çanak.
Kornea monte etmek için, bir fincan oluşturmak için kornea epitel tarafı tutmak için forseps iki çift kullanın ve fincan dolana kadar kornea içine ısıtılmış agar çözüm eklemek için steril bir transfer pipet kullanın. Agar sertleştikten sonra korneayı 60 milimetrelik yeni bir tabak agar tarafına dikkatlice yerleştirin ve tabağı bir kapakla kapatın. Daha sonra her kornea tabağına, hücre kültürü kuvözde 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içeren bir hava-sıvı arabiriminde korneabakımı yapmak için dört mililitre ekserumsuz ortam ekleyin ve dokuları sulu tutmak için çanaktaki şartlı ortamdan bir damla serumsuz ortamla günde bir damla kornea yüzeylerini ıslatın.
Gen nakavt için, azaltılmış serum minimum temel orta 50 mikrolitre ve transfeksiyon reaktif iki mikrolitre ile küçük müdahale veya siRNa beş mikrolitre karıştırın. Kornea başına azaltılmış serum orta 50 mikrolitre ile. Beş dakika sonra, birlikte iki karışımları karıştırın ve her siRNA karışımı azaltılmış serum minimum orta 200 mikrolitre ekleyin.
Sonra pipet siRNA çözeltileri her yara üzerine akıllıca düşer. Sonra korneaları kuvöze koy. Üç saat sonra, kornea yüzeylerinden siRNA yıkamak için her çanak orta kullanın, ve taze takviye serum ücretsiz orta artı antibiyotikler ile her çanak koşullu orta değiştirin.
Sonra kornea kültürlerini hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün ve iki hafta kuluçkaya yatırın. Yaralandıktan altı saat sonra kornea epiteli yok. Yaralandıktan altı gün sonra epitel yeniden büyür.
Alfa düz kas aktin ile floresan amino boyama arka stroma ön yara marjı boyunca aktif miyofibroblastlar bir gradyan ortaya koymaktadır. Alfa düz kas aktin için immüno-histokimyasal boyama yaralı artı kontrol siRNA kornea alfa düz kas aktin protein ekspresyonunda dramatik bir artış ortaya koymaktadır. Yaralanmamış ve hedef protein siRNA ile karşılaştırıldığında tedavi, yaralı kornea.
Benzer şekilde, fibronektin ekstra etki A siRNA tedavi yaralı kornea lar yaralanmamış ve hedef protein siRNA tedavi yaralı kornea ile karşılaştırıldığında upregulated olduğunu. Hedef proteinin başarılı bir şekilde yıkılacağını gösteriyor. Ayrıca, özellikle hedef protein hedefleyen toksin ile yaralı korneaların tedavisi yeniden epitelizasyon önler ve nitel hücre ölümü ile sonuçlanır, düzensiz bir matris, ve stromal vacuoles toksin konsantrasyonu tahlili iyileşme teşvik etmez düşündürmektedir.
Sonuç olarak, bu işlemi denerken bıçağı keserken dokuya paralel tutmayı unutmamak önemlidir, böylece küreye nüfuz etmez. Kimyasal yanık veya epitel kazıma dahil olmak üzere bu titretile farklı yaralama teknikleri kullanılabilir. Ayrıca epitel iyileşir ve ne oranda belirlemek için ilaç toksisite tahlilleri için kullanılabilir.
Bu bir maliyet tasarrufu ex vivo, in vivo yara iyileşme çalışmaları öncesinde olabilir organ kültürü model sistemidir.
