Bu protokol, bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ile elde edilen kornea endotel hücrelerinin organotipik uzun süreli ekimine olanak sağlayan ilk araştırma modelini sunmaktadır. Kısmen dış kornea tabakaları kaldırarak, endotel hücre kaybı önemli ölçüde azalır, kornea endotel hücrelerinin ekimi izin 15 gün. Bu nedenle, bu model kornea endotel üzerinde sulama çözümleri veya oftalmik viskoelastik cihazlar gibi ilgi belirli maddelerin veya tekniklerin etkilerini araştırmak için değerlidir.
Kısa bir süre sonra ölümden sonra çıkarılan domuz gözleri aldıktan sonra, tüm orbital adnexes kaldırmak için göz makas ve Colibri forceps kullanın. Göz yüzeylerini düzgün bir şekilde dezenfekte etmek için yüzde beş iyot PBS çözeltisine beş ila altı göz yerleştirin, tam bir dezenfeksiyon elde etmek için yüzeylerin tamamen batırılmış olduğundan emin olmak için dakikada bir kez dikkatlice karıştırarak. Beş dakika sonra, dezenfekte edilmiş gözleri bir fincan saf PBS'ye aktarın ve iyot PBS çözeltisini göz yüzeylerinden iyice yıkamak için dikkatlice karıştırın.
Diseksiyonun başlamasına başlamadan önce, beş mililitrelik bir şırıngayı iki mililitre taze çözülmüş fetal buzağı serumuyla doldurmak için künt bir kateter kullanın ve serumu 0,22 mikrometrelik bir filtreden 80 mililitre dekstran içermeyen kültür ortamına süzün. Yavaşça serum homojen bir dağıtım elde etmek için karışımı ajite, ve 12-iyi hücre kültür plaka her kuyuya orta üç mililitre ekleyin. Plaka hazır olduğunda, kornea bakan bir göz soğanı altında bir göz ampulü tutucu içine bir göz ampulü aktarın, ve yerinde göz düzeltmek için göz ampulü tutucu üzerinde göze hafif emme uygulamak için% 0.9 sodyum klorür ile dolu bir şırınga kullanın.
Merkezi korneaiçine yüzeysel olarak kesmek için standart bir kayı içeren bir trephine kullanın, daha derin 300 mikrometre, ve kolibri forceps ve üçgen bıçak ile tek kullanımlık neşter kullanın kesmek ve stroma ile yatay korneanın kısmen trephined parçası kaldırmak için. Yüzeysel olarak, deneyler sırasında kornea endoteline girmeden, endotel'in stromal tarafından farklılaşmasını sağlamak için stroma10-0 dikiş yerleştirin ve ön göz odasına ulaşılıncaya kadar trephine kesimini tam derinliğe kadar ilerletmek için kalmaksızın bir trephine kullanın. Anterior göz odasından sızan direnç ve sıvıda belirgin bir düşüş korneanın tam penetrasyonundan sonra algılanabilir.
Stromanın bir kısmını, Descemet zarını ve kornea endotellerini içeren bölünmüş kornea düğmesini 12 kuyulu plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Daha sonra her bir iyi kültür plakası üzerinde her bölünmüş kornea düğmesi için ayrı bir numara ile etiket takipleri sırasında kimlik için. Kornea düğmelerinin tümü toplandığında, 12 kuyulu plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla yerleştirin ve yedi günlük kuluçka süresi aşılırsa sekizinci gün süpernatantın yerini alın.
Lekesiz bir muayene yapmak için, 12 kuyulu bir plaka her kuyuya hipotonik dengeli tuz çözeltisi üç mililitre ekleyin ve kornea endotel hücrelerinin şişmesine neden olmak için her kuyuya dikkatlice tek bir bölünmüş kornea düğmesi yerleştirin, ve saymak için hücrelerin görünürlüğünü artırmak için. 1-2 dakika sonra, kornea endotel gerçek durumu temsili bir izlenim elde etmek için endotel üç farklı alanlarda en az üç görüntü elde etmek için bir mikroskop kamera kullanın ve daha sonra analiz için 100 mikrometre gerçek-to-scale uzunluğu ile bir ölçek çubuğu ekleyin. Ozmotik hasarı önlemek için, solüsyondan bölünmüş kornea düğmesini en fazla beş dakika sonra kültür ortamına aktarın.
Lekeli bir muayene yapmak için, ayrı Petri yemekleri bölünmüş kornea düğmeleri yerleştirin, endotel tarafı yukarı, ve yavaş yavaş her kornea endotel üzerine% 0.25 Trypam mavi çözüm damla bir pipet kullanın numune başına 90 saniye. Daha sonra, küçük bir cam kabın içinde %0,9 sodyum klorür içinde düğmeleri üç kez durulayın ve pipet kullanarak %0,2 Alizarin Red S çözeltisini endotel üzerine 90 saniye boyunca yavaşça düşürün. Sonra örnekleri az önce gösterildiği gibi hayal edin.
Görüntüleri hücre yoğunluğu ve morfoloji değerlendirmesi için hazırlamak için, görüntüleri uygun bir grafik düzenleme yazılımı programında açın ve görüntü üzerinde 100 mikrometrelik gerçek ölçekte yan uzunluğu olan bir kare projelendirin. Ölçek çubuğunu kırpmak için, ölçek çubuğunu sınırlamak ve düzenleme ve kırpma seçmek için dikdörtgen çerçeve aracını kullanın. Dosya yı ve yeniyi tıklatın ve panoseçin.
Diğer resimler için karşılık gelen pikselleri not edin ve Tamam'ı tıklatın. Dosyayı ve yeniyi yeniden tıklatın ve ölçek çubuğunun uzunluğuna göre açılan penceredeki piksellere sayım karesinin genişliğini ve uzunluğunu ekleyin. Arka plan rengi olarak beyaz'ı seçin ve tümünü seçmek için Tamam'ı tıklatın ve seçili resmi kopyalayın. Kornea endotel görüntüsünü seçin ve kornea endotel üzerinde kare yapıştırın.
Kare katmanı seçin ve opaklığı %30'a ayarlayın Sonra Tamam'ı tıklatın ve 100 mikrometrelik gerçek ölçekte slayt uzunluğuyla yansıtılan kareyle görüntüyü kaydedin. Endotel hücre yoğunluğunu değerlendirmek için, Görüntüleri ImageJ'de öngörülen karelerle açın ve hücre sayacı eklentisini açın. Kare içindeki hücreleri saymak için, karenin iki tarafındaki endotel hücrelerini saymak ve sonucu kaydetmek için baş harfe döndür'ü tıklatın.
Morfolojik parametreleri değerlendirmek için, hücre sınırı başına en az dört hücrenin ortak toplantısını, karakteristik rozet şeklindeki görünümü ve hedeflenen kareler içindeki Alizarin Kırmızı alanlarını sayın. 15 günlük bir süre içinde, bölünmüş kornea düğmeleri endotel hücre yoğunluğunda sürekli bir düşüş göstermektedir, ortalama haftalık yüzde endotel hücre kaybı ile 4.90%Gün 15 endotel hücre tabakasıboyama kornea hücrelerinin morolojik analizi sağlar, reformasyon rakamları ile birleşen hücre sınırlarının yaklaşık yüzde yedisini oluşturan, yaklaşık bir rozet örneklem başına milimetre başına bir median ve milimetre kare başına yaklaşık 13 dakik hücre kaybı. Burada hipotonik dengeli tuz çözeltisinde mikroskobik değerlendirme sırasında kornea endotellerinin temsili görüntüleri ve Trypan mavisi ve Alizarin Red S ile boyandıktan sonra görülebilir.
Bölünmüş kornea düğmeleri endotel tarafı aşağı bakacak şekilde ekili ise, geniş endotel hücre hasarı beklenebilir. Bölünmemiş kornea düğmeleri stromal şişme nedeniyle önemli ölçüde artmış endotel hücre kaybı muzdarip, ekimi 15 gün boyunca Descemet membran katlama neden, bölünmüş kornea düğmeleri ekimi 15 gün sonra büyük ölçüde korunmuş kornea endotel sergi, dağınık noktasal Alizarin Kırmızı lekeli alanlarda kanıtlandığı gibi, tek tahrip hücrelerin göstergesi. Hücre kaybını en aza indirmek için, bu protokolün herhangi bir adımboyunca kornea endotel dokunmamaya dikkat edilmelidir.
