We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

Etik Açıklama: Bu çalışmada kullanılan gözler Hayvan Araştırma Açıklık üzerinde Bildirgesine göre kullanılmıştır: Mikrocepler ile donatılmış PLGA Biyobozunur Membranlarının 1. Fabrikasyon <ol><li> Halka iskeleleri microstereolithography ve elektro teknikleri 31 bir kombinasyonu ile oluşturulmuştur. Esas olarak, işlem microstereolithography ve (ii) temel PEGDA yapının üretimi için kalıp üzerinde electrospinning (bu durumda bir mikrofabrike halka) PEGDA şablonları 2 bölüm (i) oluşturulması özetlenebilir. Bu iki adım (Şekiller 1 ve 2), aşağıda ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. <ol><li> Microstereolithography tarafından PEGDA şablonlar Fabrikasyon (microSL) <ol><li> Birinci tabaka (L1), yapının taban ve at nalı morfolojiye 6 mikrocepler gösteren ikinci tabaka (L2) sahip olan, bir 2 tabakalı modeli kullanılarak imal halkaları300-500 mikron boyutlarda bir dizi es. PEGDA halkaların imalatı yakın zamanda bu grup 22 tarafından tanımlanmıştır. <ol><li> Uygun herhangi bir çizim programı kullanarak bir 1,2 cm siyah bir daire çizerek L1 oluşturun. </li><li> Aynı şekilde, ancak 8 L2 oluşturma beyaz, 0.5 x 0.35 mm, at nalı şekilli yapılar yer alır. Siyah daire yapısı içinde küçük beyaz at nalı şekiller dağıtın. </li><li> JPEG formatında kaydet L1 ve L2. </li></ol></li><li> Koyu renkli bir cam şişe içinde, 20 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde, kamforkinon, katiyonik bir ışık başlatan 1 w / w ile% polietilen glikol diakrilat (PEGDA, Mn = 250 g / Mol) karıştırılır. </li><li> Set-up teleskopik lens düzenlemesini kullanarak microstereolithography lazer ışını genişletmek ve daha sonra bir bilgisayar programlanabilir dijital multimirror cihazı (UV-etkin DMD starter kit) üzerine proje. NOT: DMD 10 cm odak uzaklığı tüp lens aracılığıyla bir ayna üzerine (bu durumda bir halka) görüntüyü yansıtıyor. Görüntü daha sonra gümüş-COA tarafından yönlendirilirted ışıkla polimer (PEGDA) ihtiva eden bir şişe içine yansıtır. </li><li> Ayarlayın ve dikkatle kurmak microstereolithography bir optik temizleyin. </li><li> 12-çukurlu bir doku kültür plakasının bir kuyuya PEGDA karışımın 300 ul koyun. Oyuklar, sertleştirme sonunda yapısının kolay çıkarılması için teflon veya diğer yapışmayan malzeme ile önceden kaplanmış olduğundan emin olun. </li><li> Mavi lazer Anahtarı (MBL-III 473 nm; 150 mW) ALP3-temel yazılım içine ve L1 karşıya önceden PC&#39;de yüklü. 60 sn için ilk katmanı ışın tedavisi. NOT: ALP3-Temel PC ve Dijital micromirror cihaz arasındaki bağlantıyı sağlayan USB arayüzü. </li><li> , PEGDA 250 ul daha iyi bir eklemek, yukarıda tarif edilen ve 60 saniye boyunca ışın L2 olarak L2 yükleyin. </li><li> Sabitlenmemiş polimerin çıkarın ve izopropanol O / N ile halka yıkayın. </li></ol></li><li> Biyobozunur PLGA&#39;nın Fabrikasyon elektrospinning kullanarak Membranı Not: PEGDA halkaları kalıp olarak kullanılmıştırs, üzerinde PLGA bu şablonlar üzerinde bükülmüş olarak PLGA yatan topografya üreyen ile electrospun edildi. Iplik sonra, PLGA polimerin tabaka kolektöründen soyuldu. Nihai zar PLGA metalik toplayıcıya bağlı kalmıştı PEGDA halkaları içermiyordu. <ol><li> Statik bir elektro toplayıcı oluşturmak için bir elektrolitik alüminyum levha üzerine PEGDA halkaları (12 cm x 20 cm) dağıtın. </li><li> Iletken karbon bant kullanarak halkaları takın. NOT: Bir kez Elektrospinning için şablon olarak yeniden kullanılabilir oluşan bu halkalar. </li><li> Eğirme için polimer solüsyonu hazırlayın. Konsantrasyon ağ / ağ% 20 olan diklorometan (DCM) &#39;de: PLGA (glikolid (48 mol%), 44 kg / mol&#39; 50/50 DL-laktit (52 mol%)) içinde çözülür. </li><li> Stir O / N kullanmadan önce. </li><li> Bir şırınga pompası Place 4 insülin enjektörleri (uçlu, 0.8 cm iç çapı iğne künt). NOT: Dört şırıngalar bir tek şırınga ile çalışmaktan daha hızlı elektrospinning sağlanmalıdır. </li><li> Her şırıngada PLGA solüsyonu, 2.5 ml yükleyin. </li><li> Electrospin kullanılarak 30 ul / dak akış hızı ve 12 kV arasında değişen 15 gerilimleri göstermektedir. Iğne ve 15 cm kolektör arasında mesafe bırakın. </li><li> 1 saat ve 30 dakika boyunca dikkatli bir şekilde Electrospin ve son olarak PEGDA halkaları destek kolektöründen PLGA electrospun Ön soyun. </li><li> Dairesel bir delik zımba kullanılarak ve merkezinde konumlandırılmış halka yapısı bırakarak 22 mm çaplı daire içine electrospun iskeleleri kesin. </li></ol></li></ol></li></ol> PLGA Microfabricated Membranlarının 2. Uzun vadeli Depolama Not: PLGA halkaları fabrikasyon ve akredite dış şirketler tarafından sterilize edildi; Örnekler 25-40 KGy bir dış doz aralığında ışınlanmıştır. <ol><li> Küçük bir kapta membran (Plastik petri) mount ve bir tıbbi sınıf torba içine koyun. </li><li> Desikantlar için küçük bir filtre çanta oluşturmak için filtre kağıdı kullanın. To, çanta oluşturmak filtre kağıdı (125 mm çapında) kat ve yarım sonuçlanan yarım daire kesilmiş; Daha sonra bant kullanarak bir araya biter mühür. <ol><li> Sırasıyla silika portakal, kobalt (II) klorür ve bakır (II) sülfat, 1 g üç filtre kağıt poşet doldurun. </li><li> Electrospun membran ile birlikte tıbbi sınıf çantanın içindeki kurutucu üç çanta koymak. </li></ol></li><li> Depolama süresince herhangi bir nem birikimini tespit etmek çantası için piyasada mevcut altı nokta nem göstergesi kartı ekleyin. </li><li> Vakum ve çanta mühür bir vakum ısı mühür makinesi kullanın. </li><li> Γ-ışınlama için harici bir şirkete halka zarları gönderin. </li><li> Mağaza% 5 CO2 içeren bir inkübatör içerisindeki nemli bir ortamda 37 ° C -20 ° C arasındaki sıcaklıklarda bir geniş olarak PLGA zarların γ-maruz bırakıldı. </li><li> Mesaj depolama, nem seviyesi% 30 altında olduğunu doğrulamak için nem göstergesini inceleyin. </li><li> Use Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) lif bütünlüğünü değerlendirmek için. </li></ol> Limbal Eksplantlarından 3. İzolasyon Tavşan limbal eksplant (tavşan tüketimi için yetiştirilen bir çiftlikte elde edilen) tavşan gözlerinde izole edilmiştir. <ol><li> Antiseptik çözeltisi (% 3) kullanarak tavşan gözlerini dezenfekte. </li><li> Korneayı çevreleyen herhangi bir aşırı doku kaldırarak gözleri temizleyin. </li><li> Bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak kornea geri kalanından (kornea (şeffaf) ve sklera (beyaz) arasında ince, daire şeklindeki bir alan olarak tanımlanan) limbal bölgeyi ayırın. </li><li> Diseksiyon mikroskop altında (1.5 civarında cm uzunluğunda) parçalar halinde kesilir. </li><li> 1 dakika boyunca% 1.5 antiseptik solüsyon ile limbal kesimleri dezenfekte edin. </li><li> Bir neşter bıçağı ile küçük parçalara (100-500 mikron) içine limbal kesimleri kesmek. </li><li> Kültür ortamı içindeki dokunun küçük parçalar halinde saklayın (DMEM Glutamax: Ham&#39;s F12 (1: 1),% 10 fetal sığır serumu, 1 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin, EGF, 10 ng / ml ve 37 ° C&#39;de insülin 5 mg / ml) ve% 5 CO2, kullanılıncaya kadar (en fazla 60 dakika). </li></ol> Limbal eksplantlardan 4. Hücrelerin üremesi Tavşan, limbal eksplantlar vakumlanmış ve -20 ° C&#39;de 6 ay boyunca saklanabilir her ikisi taze eğrilmiş mikrofabrike membranlar membran üzerine yerleştirilmiştir. <ol><li> Kat fibrin yapıştırıcı 15 ul halka iskeleleri: fibrin dağıtmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak (1, 2.5 U / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, insan plazmasından 18,75 mg / ml trombin bir konsantrasyonda insan plazmasından fibrinojen 1 karışımı) eşit. </li><li> Bir 25 G iğne bir teşrih mikroskobu ile PLGA mikrocepler doğrudan doku eksplantlar. </li><li> Eksplantlarının koparmasını önlemek için çok hafifçe hücre kültürü ortamı ekleyin. <ol><li> Her 3 gün (medya bölümünde 3.7 tarif tarifi) ve k medya değiştirin37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 2 hafta boyunca kültür EEP ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> PBS ile 3 yıkama ile takip edilen, 10 dakika boyunca% 3.7 tamponlu formaldehid ile örnekleri sabitleyin. </li><li> 4 1 ug / ml &#39;de inkübasyon ile Counterstain, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ya da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca propidyum iyodür (PI). </li><li> PBS içinde 3 kez yıkayın ve folyo ile kaplı örnekleri saklamak. </li><li> Görüntü 543 nm ve 800 nm (iki-fotonlu) dalga boylarında, bir floresans mikroskobu kullanılarak örnekleri. </li></ol> 5. Ayar-up Tavşan Yaralı Kornea 3D Modeller <ol><li> Temiz ve yukarıda tarif edildiği gibi tavşan gözlerini dezenfekte. </li><li> 5 dakika için% 0.14 amonyum hidroksit içine daldırılarak tavşan gözlerini yara. </li><li> PBS içinde yıkayınız ve bir sclerotome bıçakla epitel kazınması. </li><li> Kesme ve kalan doku kaldırarak kornea-skleral düğmesini izole. </li><li> Üzerine kornealar aşağı epitel tarafı yerleştirinsteril bir fincan ve DMEM&#39;de yapılan% 0.5 agar ile doldurun. </li><li> Bir kez küçük tabaklara kadar kornealar epitel yan koymak ve limbal alana kadar kültür ortamı (yukarıda tarif tarifi) ekleyin, ayarlayın. NOT: Bütün kornea örtmeyin; hava-sıvı ara organ kültürü tutun. </li></ol> Limbal Eksplantlarından ve Tavşan Kornea 3D Modelleri Yüzük iskelelerinin İçerme 6. İzolasyonu <ol><li> Kat fibrin yapıştırıcı 15 ul halka zarlar: yukarıdaki hücre kazıyıcı .Use (1 2.5 U / ml bir konsantrasyonda 18.75 mg / ml trombin konsantrasyonunda fıbrinojen, 1 karışımı) tarif edildiği gibi. </li><li> Bir 25 G iğne bir teşrih mikroskobu ile PLGA mikrocepler doğrudan doku eksplantlar. </li><li> Yukarı bakacak şekilde eksplant ile ve hava-sıvı arayüz şartlarında çıplak bırakılmış kornealar dokusu eksplantlan ile halkaları yerleştirin. (Bu koşullar, daha önce 22 tarif edilmiştir). </li><li> Için organ kültürü modellerini korumak37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 4 hafta ve% 5 CO2 her 2 günde bir ortam değiştirilmesi. </li></ol> Değerlendirme Kornea Rejenerasyon 7. ve Hücre Bakım Kök <ol><li> 4 hafta sonra,% 3.7 formaldehit kullanarak kornealar sabitleyin. </li><li> Geleneksel histoloji 6 mikron parafin bölümleri üretmek için kornealar işleyin. </li><li> Hematoksilen ve eozin (H &amp; E) ile boyayın. </li><li> Donmuş kesitler imünosito kimya, ksilen (3 dk) olarak bölümleri mumunun ve% 100 etanol (1 dakika),% 70 etanol (1 dakika) ve damıtılmış su (2 dakika) nemlendirir. </li><li> Küçük alanları sınırlandırmak ve antikorun aşırı kullanımını önlemek için bir Dako kalem kullanarak bölümleri Delineate. <ol><li> 20 dakika boyunca (37 ° C),% 0.05 tripsin (100 ul) ile tarif bölgelerini tedavi. </li></ol></li><li> PBS ile iyice yıkayın ve 1 saat boyunca% 10 keçi serumu (engelleme) 100 ul ekleyin. </li><li> Fare monoklonal antikoru cytokera 100 ul ile inkübe örneklerikalay 3 (CK3) ve 4 ° C &#39;de% 1 keçi serumu O / N p63 100 ul. </li><li> PBS ile yıkayın ve biyotinile edilmiş ikincil anti-fare antikoru 100 ile tedavi ul (1: 1000,% 1 keçi serumu) oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (100,% 1 keçi serumu 1) FITC streptavidin 100 ul ilave edin. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi DAPI ile örnekleri tedavi edin. </li><li> Görüntü 800 nm&#39;de (iki-fotonlu) ve 488 nm dalga boyunda bir flüoresan mikroskop kullanılarak örnekleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Ambati, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+avascularity+is+due+to+soluble+VEGF+receptor-1.">Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1.</a> Nature. 443, 993-997 (2006).</li><li>Reinach, P., Cap&#243;-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K., Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophthalmic+Diseases+And+Drug+DeliveryOphthalmology+Research.">Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research.</a> Ch 2, Ocular Transporters. 2, 17-46 (2008).</li><li>Kinoshita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+Human+Ocular+Surface+Epithelium.">Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).</li><li>Fatt, I., Bieber, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady-state+distribution+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+the+in+vivo+cornea:+I.+The+open+eye+in+air+and+the+closed+eye.">The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye.</a> Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).</li><li>Shortt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Limbal+Epithelial+Stem+Cell+Niche:+Novel+Imaging+Techniques+Permit+In+Vivo+Observation+and+Targeted+Biopsy+of+Limbal+Epithelial+Stem+Cells.">Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells.</a> STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).</li><li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).</li><li>Thoft, R. A., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+X,+Y,+Z+hypothesis+of+corneal+epithelial+maintenance.">The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance.</a> Investigative Ophthalmolog., &amp; Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).</li><li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+epithelial+repair:+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation.">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).</li><li>Djalilian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Notch+signaling+during+corneal+epithelial+proliferation.">Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation.</a> Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).</li><li>Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+Stem+Cells+of+the+Corneal+Epithelium.+Survey+of+Ophthalmology.">Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology.</a> Survey. 44, 415-425 (2000).</li><li>Dravida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+scaffold+for+culturing+limbal+stem+cells:+a+promising+alternative+for+clinical+transplantation.">A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).</li><li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+Stem-Cell+Therapy+and+Long-Term+Corneal+Regeneration.">Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration.</a> New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).</li><li>Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivated+corneal+epithelial+stem+cell+transplantation+in+ocular+surface+disorders.">Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders.</a> Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+cultivating+limbal+derived+corneal+epithelium+on+human+amniotic+membrane+for+clinical+transplantation.">Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).</li><li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+transplantation+for+the+management+of+corneal+epithelial+defects:+an+in+vivo+confocal+microscopic+study.">Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study.</a> British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).</li><li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Stromal+Integration+of+Multilayer+Amniotic+Membrane+Transplantation+in+Corneal+Ulcers.">In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers.</a> American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).</li><li>Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+transplantation.">Amniotic membrane transplantation.</a> British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).</li><li>Gicquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor+Variations+in+Amniotic+Membrane+Used+for+Ex+Vivo+Tissue+Constructs.">Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).</li><li>Connon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variation+in+transparency+of+amniotic+membrane+used+in+ocular+surface+regeneration.">The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).</li><li>Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Membrane+for+Ocular+Surface+Reconstruction:+Donor+Variations+and+the+Effect+of+Handling+on+TGF-&#946;+Content.">Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-&#946; Content.</a> Investigative Ophthalmolog., &amp; Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).</li><li>Sitalakshmi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Cultivation+of+Corneal+Limbal+Epithelial+Cells+in+a+Thermoreversible+Polymer+(Mebiol+Gel)+and+Their+Transplantation+in+Rabbits:+An+Animal+Model.">Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).</li><li>Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microfabricated+artificial+limbus+with+micropockets+for+cell+delivery+to+the+cornea.">Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea.</a> Biofabrication. 5, (2013).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+poly(lactide-co-glycolide)+electrospun+scaffolds+to+deliver+cultured+epithelial+cells+to+the+cornea.">Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea.</a> Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+corneal+surface+regeneration+using+a+biodegradable+synthetic+membrane+and+limbal+tissue+explants.">Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants.</a> Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).</li><li>Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+Hydrogels+for+Stem+Cell+Bioengineering+and+Tissue+Regeneration.">Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration.</a> Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+Materials+for+Controlling+Stem+Cell+Fate.">Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate.</a> Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).</li><li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing.">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li><li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput.">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li><li>Truckenm&#252;ller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies.">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li><li>Ortega, &. #. 2. 0. 5. ;., Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair.">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li><li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışma, içlerinde ihtiva microfeatures electrospun zarların imalat ve nasıl vakum ambalaj, gama ışıması ve daha sonra depolama, kullanımdan önce, klinik kullanım için bu tür membranlar hazırlamak için (b) (a) bir yöntem açıklanır. Bu özel uygulama biz limbal kök hücre nişler fiziksel özelliklerini taklit mikrocepler içeren PLGA zarlarını geliştirdik. Bu çalışmanın amacı, (i) doku rejenerasyonu ve (ii) daha iyi anlaşılması ile okuyucuya sunmak için kök hücre nişler katkýya araştırma için microfeatures içeren iskeleleri tasarım ve imal için gerekli bilgi ile okuyuculara sunmak yöntemlerini tanımlamak için vardır süresi uzun süreler boyunca electrospun iskeleleri saklamak için nasıl. Klinik uygulama açısından, halka zarların depolama büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, halkanın bozulması 6 aylık bir süre boyunca çalışılmıştır. Parçalanmazarları sadece nemsiz işlemi durdurulur membranlar tutarak çok hidroliz ile tahrik edilir. Blackwood et al. PGA için PLA oran değiştirilerek, membranın bozulması 32 değiştirir bildirmiştir. Bu çalışma ayrıca, PGA miktarının arttırılmasıyla, electrospun membran bozulma oranı, in vivo 22 artış göstermiştir. Burada vakum bazı kurutucu ile birlikte membranlar, paketleme ve onları aydınlatma ve 6 ay boyunca düşük sıcaklıklarda saklayarak ile, lif bütünlüğü ve yıkımı hiçbir değişiklik olmadığını gösterilmiştir. Şu anda, 6 ay kadar biz 1 yıl, -20 ° C&#39;de 22 de düz electrospun zarlarında rapor ve şimdi -20 ° C&#39;de depolanması için yayınlanmadı verilere sahip olmuştur bu membranlar mikrocepler ancak depolama verilerini içeren okumuş gibidir herhangi bir bozulma belirtisi olmadan 2 yıl boyunca. Böylece uzun süreli depolama için -20 onları kuru saklamak için tavsiye edilebilir6 C ama (muhtemelen daha uzun) en az 6 ay için daha da Hindistan oda sıcaklığında saklayın mümkündür. Bir nem göstergesi dahil ambalaj onlar amaca uygun olacak, bu durumda kuru zarları muhafaza ettiğini kontrol kolay bir araç verir. Mikrocepler içinde limbal eksplantlarını verirken 3D kornea modelleri bu halkaları hücrelerinin transferi gösterilmiştir. Bu grup, en son düz bir PLGA membranlar (halka yapıları olmadan membranlar) üzerinde eksplantların 24 yerleştirerek bir in vitro tavşan kornea modeli üzerine hücre transferi bildirilmiştir. Mevcut mikrofabrike iskeleleri hücre aktarımını kullanarak biz şimdi özellikle microfeatures içindeki doku eksplantlarını bulmak gibi bir adım daha atılmıştır. Nişler içinde doğrudan eksplantlarının yerleştirmek için yeteneği de cerrah ilk limbal kök hücreleri genişletmek için bir temiz oda ihtiyacı kaçınarak cerrahi tiyatro doğrudan membranlar kullanmanıza olanak sağlar. Kel bu parça olmasına rağmenk, kornea hastalığı için cihazların geliştirilmesinde üzerine odaklanmıştır, bu mikroimalat teknolojisi, aynı zamanda pek çok diğer uygulama için cihazlar geliştirmek için de uygulanabilir. Gelecekteki çalışmalar gibi deri ve kemik gibi diğer dokuların yenilenmesi için yapıların imalat inceleyeceğiz. PEGDA mikroyapıların tasarımı ve ilk fabrikasyon zaman alıcı olabilir iken, bir kez yapıların bozulma olmadan birçok kez tekrar edilebilir fabrikasyon. Bu nedenle, elektroeğirme PLGA mikrostrüktür biyolojik olarak parçalanabilir bir membran daha sonra imalat kollektörün montajından sonra düz (&#39;yapılandırılmamış&#39;) zarların üretimi için benzer bir hızda gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, çok kalıpların imal edilmesi için microstereolithography açıklanmasına rağmen, örneğin 3D-baskı veya enjeksiyon tipi kalıplama gibi başka üretim yöntemleri de kullanılabilir. Bu duruma göre, temel kalıp PE yerine diğer polimerler ya da metallerden yapılabilmektedirGDA. Gibi, bu tekniği çok yönlü ve araştırmacılar kolayca kendi ihtiyaçları ve imkanları maç yöntemini uyarlayabilirsiniz. 30uM altında özelliklere sahip yapıların hazırlanmasını izin vermez, bu çalışmada kullanılan içi microstereolithography kurulum; Bu Burada anlatılan kornea uygulama için bir sınırlama değil ama diğer modellerin tasarımında önemli olabilir. Bu durumda diğer teknikleri gibi 2 foton polimerizasyon (2PP) Ancak elektro tekniği (bu şu anda bizim grup tarafından incelenmiştir ediliyor) alt-mikron ölçekte yapıların çoğalmasını izin vermeyebilir ilgi olabilir. Üretim sürecinde kritik adım ve zaman foto-başlatıcı miktarları ayarlanarak kontrol edilebilir PEGDA şablonlarının overcuring kaçınmak (i). (Ii) bu sıcaklık ve nem gibi elektro koşullarını kontrol. (Iii) uygun bir şekilde saklanması electrospuvakum ambalaj ve kurutucu kullanarak n halka membranlar. Özet olarak, membranın microfeatures içinde, limbal doku eksplantlarında yerleştirerek bir tavşan kornea yaralı ve korneanın yeniden epitelizasyonunu sonra üzerine hücresi alanları, hücre transfer eksplantlar hücre büyümesinin göstermiştir. Farklı sıcaklıklarda saklandı zarların bozulması üzerine de çalışmalar yapılmış ve membranlar, uzun süreli depolama izin veren bir paket protokol, klinik kullanım için membranlar geliştirilmesinde önemli olmakla, ikinci geliştirilmiştir.

Kornea, gözün avasküler merkezi en dış doku, görme 1 &#39;de yer en önemli dokuların biridir. Kornea işlevini korumak çeşitli hücre türleri vardır. Korneanın en dış tabaka kalınlığı 2 ile ilgili olarak 5-7 kat olabilir epitel hücreleri içerir. Bu katman, kornea 3 içine bakteri istilasını engeller ve oksijen 4 girişine izin verir. Bu rapor edilmiştir limbusu 5,6 olarak bilinen kornea periferal bölgesinde (120-150 um boyutundaki) niş ve kript kornea epitel yalan kök hücreleri. Kök hücre bölünmeleri, aynı zamanda geçici yükseltme hücreleri olarak bilinen yavru hücre nişler dışına seyahat gibi bölünme hücreler sentripetal içeriye doğru hareket ve Çoklu santral kornea bölgede 7,8 de terminal olarak farklılaşmış hücreler elde ediyor. Bu hücreler rutin göz e açıp kapayıncaya ile sildi edilir9 altında yeni hücreleri xposing. Epitel kök hücrelerin yer olmanın yanı sıra, aynı zamanda kenar şeridi kornea bölgesinin 10 uzak vaskülarize konjonktiva tutulmasında önemli bir rol oynar. Limbusa hasar termal / kimyasal yanıklar, radyasyon ve genetik hastalıklar 10 neden olabilir. Bu durumda, Limbustan bariyer, konjonktiva hücre kornea üzerine taşımak için izin bölgeyi vascularizing, bazı durumlarda ağrı ve körlüğe neden bozuldu. Durum limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) 10 olarak bilinir. Farklı doğal substratlar kornea rejenerasyonuna yardımcı maksimum kök hücre taşıyıcılar olarak bildirilmiştir. Örneğin kolajen-bazlı membranlar Dravida ve ark. 11 Rama&#39;nın ve çalışma arkadaşları tarafından 12 112 hasta ile yapılan bir çalışmada, fibrin kullanımını rapor kullanılmıştır. Mevcut tedavi, ancak en yaygın olarak kullanılan yöntem deyüzeyinde 13,14 üzerinde bir doku bankası kültür ve limbal epitel hücrelerinden insan amniyotik zar kullanmaktır. Bir tek tabakalı oluştuktan sonra, amniyotik membran cerrahi öncesinde bu hücre nakli 14 ondan kaldırıldı tüm konjonktiva hücreleri ve skar dokusu hasarlı kornea üzerine kadar hücre tarafı yapıştırılır. Amniyon zarı epitel 15,16 yenilemek için soyulmuş alana bağlı epitel hücreleri bırakarak haftalar ve aylar içinde düşürür. Ancak bu teknik, klinik olarak yaygın alımını kısıtlamak, bir kaç pratik sorunlar hala var vizyonunu yeniden başarılı olmuştur. Amniyotik membran insan dokusu olduğu gibi hastalarda hücre nakli için kullanılmadan önce iyi doku bankacılık prosedürleri kullanılarak tarama geçmesi gerekiyor. Bu tarama, sadece hastalıkların bulaşma riskini azaltır ama tamamen o 17 yok edemez. Buna ek olarak p değişkenlik raporlar bulunmaktadırnedeniyle arası donör varyasyon 18,19 ve farklı işleme yöntemleri 19,20 ile amniyotik membranın performansı alabilirsiniz. Hastalık bulaşma riski küçük yanında cerrahi merkezleri hepsi için geçerli değil de işletilen doku bankaları, erişimi için gereksinim yoktur. Amniyotik membran göreceli olarak başarılı olsa da, kornea hastalığının tedavisi için yeni sentetik biyolojik olarak parçalanabilir bir taşıyıcı hücre alternatifler geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Sentetik taşıyıcılar prosedürleri bankacılık yanı sıra hastalık bulaşması ve inter-donör değişkenlik küçük riskini ortadan kaldırmak için ihtiyaç aşmak olur. Bu anlamda, bu tür polietilen glikol 21,22 ve 23,24 PLGA gibi maddeler incelenmiştir. Insan amniyotik zara sentetik bir alternatif geliştirilmesinde umutla kültürlenmiş hücrelerin hayatta kalma yardımcı içine istenen tasarım özellikleri olasılığı da vardır. Inchücre davranışı belirli kontrolü için biyomalzeme cihazlar içinde microfeatures bir ham hayal ilgi gelişmekte olan bir alandır. Yapay kök hücrelerin gelişimi 25-30 nişler doğru Birçok yazar çalışmalarını bildirdi. Bu grup, son zamanlarda, limbal epitel hücrelerinin 22 teslim ve epitel hücreleri, limbal 31 desteklenmesi için mikrofabrike cepleri ihtiva eden biyolojik olarak parçalanabilir bir electrospun zarların üretimi için kullanılan bir yöntem için bir mikrofabrike PEGDA fibronektin biofunctionalized yapay limbusun oluşturulmasını rapor etmiştir. Bu çalışmanın amacı, bir ölçüde hücreler vücutta bulunan kök olduğu mikroçevrelerde taklit microfeatures ihtiva eden biyo-malzeme cihazların geliştirilmesi için yeni bir üretim teknolojisinin geliştirilmesidir. Bu veric gösteren biyolojik olarak parçalanabilir bir mikrostrüktürlü zarların imalat sağlar ve elektrospinning microstereolithography birleştiren bir teknik geliştirdilerdoku rejenerasyonu uygulamalar t potansiyeli. Bu, bu çalışmada bu teknik, kornea yenilenme halkalarının imalatı için uygulanmış olsa da, teknoloji epitelyal dokuların geniş bir rejenerasyonu, örneğin, deri, ağız için cihazların imalatı için tatbik edilebilir olduğunu fark etmek önemlidir mukoza, bağırsak, solunum ve mesane epitel. Spesifik olarak, bu çalışmada, kornea hücreleri sunmak için amniotik zara benzer bir şekilde işlev gören bir biyo-bozunabilir sentetik zar geliştirdik. Bu membran yaklaşık 300 um mikrocepler içerir ((büyük Vogt Pallisades bir limbal crypts 150 civarında mikron)). Son olarak, bu membranların bozulma görülmeksizin fazla 6 ay boyunca -20 ° C de saklanmasını sağlayan bir ambalaj protokolunu oluşturmuşlardır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

Kornea sorunlar tüm dünyada yaşam kalitesini önemli ölçüde azaltarak milyonlarca insanı etkilemektedir. Kornea hastalığı gibi Aniridi veya Steven Johnson Sendromu gibi gibi kimyasal yanıklar ve radyasyon gibi dış etkenlerden hastalıklardan kaynaklanabilir. Mevcut tedaviler, (i) korneal greft kullanımı olup, (i) laboratuarda genişletilmiş ve taşıyıcılar (örneğin, amniyotik membran) teslim kök hücre kullanımı; Bu tedaviler nispeten başarılı olan ama ne yazık ki 3-5 yıl sonra başarısız olabilir. Tasarımı ayrıntılı olarak kök hücreler kornea ikamet fizyolojik ortamının taklit edebilen yeni bir biyo materyal kornea cihazların üretimi için, bir ihtiyaç vardır. Limbal kök hücreler Vogt Palisades&#39;de olarak bilinen özel nişler (kornea ve sklera arasındaki dairesel alan) limbusta bulunmaktadır. Bu çalışmada iki kesim-kenar üretim teknikleri (microstereolithography ve electrospinn birleştiren yeni bir platform teknolojisini geliştirdikbir ölçüde limbusa taklit kornea zarların imalatı için) ing. Bizim membranlar Vogt Palisades göz gibi koruma hücreleri sağlamayı hedefliyoruz yapay mikrocepler içerir.

Electrospun mikrofabrike halkaları (Şekiller 1 ve 2) ve microstereolithography üretebilmektedir bir kombinasyonu kullanılarak elde edilmiştir. Farklı boyutlarda PEGDA halkalar microstereolithography (Şekil 3) kullanılarak imal edildi; Bu teknik cm civarında olması ve microfeatures aynı anda dahil edilmesi üretim yapıları sağlar. Bu durumda, değişik çaplarda halkaların 350-500 um&#39;lik mikrocepler içeren 1.2-1.6 sm kadar (Şekil 4) imal edildi. , Üreten sterilizasyon ve gelecekteki klinik kullanım için malzemelerin ambalaj açısından tıbbi dereceli poşetlerde olduğu vakum paketleme anlamlı PLGA membranların (Şekil 5) uzun süreli saklama ulaşmak için yeteneği gelişmiş bulundu; 0.12 mm kalınlığında bir tıbbi sınıf, torba (PET / Folyo / LDPE) ile kullanılması, uzun bir raf ömrü elde etmek için izin verdi. Bu Membr göndererek araştırıldıHindistan ve zarlarda işbirlikçilerimizden için anes oda sıcaklığında ve kasıtlı olarak nemli koşullarda (nemli bir kuluçka makinesinde) 37 ° C, -20 ° C &#39;de aylık bir periyot süresince depolanmıştır. Şekil 5, Şekil bu depolama kasıtlı olarak tahrik edici koşulları kullanılarak da Nemli koşullarda 37 ° C, membranlar koşullar dolu olmayan vakum altında yaklaşık 1 ay boyunca sadece kararlı, ama vakumlu koşullarda (Şekil 5 ve Tablo 1) kapsamında 3 ay saklanmasını sağladılar. Tablo 1 bile, su emme ve lif, bir ikinci torba seçimine özen ise şişme vesile olmak için seçilen şartlar altında elde edilebilir depolama şartlarında bir iyileşmeyi ortaya koymaktadır. Halkalar Farklı koşullar altında (I) &#39;in, taze yapılmış ve (ii) 6 ay (Şekil 6) depolanabilir yüzükler limbal eksplantlar hücre büyümesinin desteklenir. Hücre devir 4 hafta sonra elde edilmiştir zaman çoğ3D yaralı modelleri PLGA membranlar acing. Hücreler, daha önceden soyulmuş kornea yeni epitel (Şekil 7) oluşturmak zarlar üzerine yerleştirilen doku eksplantlarında doğmuştur. Ve negatif kontroller (yaralı kornea) Pozitif (herhangi bir tedavi olmadan kornea) de zaman aynı dönemler için kültür içinde muhafaza edilmiştir. Negatif kontroller, hiçbir ilave hücrelerin yokluğunda yeni epitel oluşumu eksikliği doğrulandı. İmmünositokimya onlar kornea farklılaşma işaretleyici Ck3 (Şekil 7E) için pozitif beri eksplantlardan dışarı büyüyen hücreler kornea epitel hücreleri olduğunu gösterdi. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> Microstereolithography Şekil 1. Şematik PEGDA halkaları oluşturulması için kurulmuş. her.within-sayfa &quot;her zaman&quot; =&gt; <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> Bir şablon olarak PEGDA mikrofabrike halkaları kullanılarak sürecini electrospinning Şekil 2. şematik. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3 (A). Mikrofabrike PLGA zarların iplik için statik bir toplayıcı (PEGDA halkalar ile elektrolitik alüminyum levha) bir örneğini gösterir (B) ve (E) farklı electrospun paspaslar statik toplayıcıları soyulacağına gösterir. (C) gösteriler altta yatan bir yüzeyin imalatı için microstereolithography kullanarak çok yönlülüğünü vurgulayan farklı boyutlarda PEGDA şablonları. (D), bir PLGA mikrofabrike kopyasını gösterir./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> At nalı microfeature (A) bir PEGDA halkasının Şekil 4. SEM görüntüsü; bir microfabricated cepte (B) yüksek büyütme SEM görüntüsü. At nalı microfeature (C), bir PLGA halkanın Faz kontrast bir görüntü; bir microfabricated cepte (D) yüksek büyütme faz kontrast görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /><bvakum ve non-vakum depolama sıcaklığı ve zamanın r /&gt; Şekil 5. Etkisi (44 kg / mol) 6 ay boyunca mikro-fabrikasyon halkaları. Membran bütünlüğü tam sağlam lifleri gibi gol oldu PLGA (50/50) membranlar dolu (+++), bir elyaf lifi (+) birleştirme (++), şişme veya bozulmamış elyaf (-). SEM görüntüleri ve üç desiccant&#39;lardır (silika turuncu, kobalt (II) klorür ve bakır (II) sülfat) lif bütünlüğünün veya nemde hiçbir değişiklik gösteriyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil taze biyolojik olarak parçalanabilir bir PLGA halkalarında, limbal eksplantlardan LEC gelişimini gösteren 6. Floresan görüntüleri (A, B) ve -20 ° C&#39;de 6 ay süreyle saklamanın ardından halkalarda° C (C, D). Görüntü (A) ve (B) &#39;DAPI (mavi) ve sırasıyla, propidyum iyodür (kırmızı) ile boyanmış hücrelere karşılık gelmektedir. Resim b mikrofabrike cebe yerleştirilen bir eksplant bir konfokal z yığınından bir dikey görünüşüdür. Görüntüler (C) ve (D) p63 (yeşil) için pozitif boyanma gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> . Şekil 7 (A) Daha önce fibrin yapıştırıcı ile kaplanmış olan bir platform üzerinde yer alan bir halka iskele ve dokusu eksplantlan ile bir tavşan kornea yaralı bir modelini göstermektedir (B) ve (C), pozitif ve negatif kontroller olarak; pozitif kontrol taze bir haham<html> . t, saydam tabaka ve negatif kontrol epitel kasıtlı olarak kullanılmıştır (negatif kontrol 4 hafta kültüre oldu) uzaklaştırılmıştır, bir saydam tabaka (D) kültür içinde 4 hafta sonra, bir doku mühendisliği korneanın H &amp; E ile bir görüntüdür; Şekil niş yerleştirilen eksplantlar çıkan hücreler tarafından oluşturulan yeni çok-tabakalı epitelyum gösterir (E), limbal eksplanttan hücre gelişimini gösteren bir immünositokimya görüntüdür. çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı ve hücreler sitokeratin 3 pozitif boyanma gösterir vardır, bir kornea farklılaşma işaretleyici (yeşil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50/50) </td><html> x, 37 ° C&#39;de nemli bir saklandı zarlar için &quot;&gt; Elyaf bütünlüğü </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Gün 0 </td><td style="width:64px;"> Ay 1 </td><td style="width:64px;"> Ay 2 </td><td style="width:64px;"> Aylık 3 </td><td style="width:64px;"> Ay 4 </td><td style="width:64px;"> Ay 5 </td><td style="width:64px;"> Ay 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> Paketli Sigara Vakum </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> Vakumlu (Çanta A) (PE, PA Kompozit) Kalınlığı: 0.14 mm </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> Vakumlu (Çanta B) (PET / Folyo / AYPE) Kalınlığı: 0.75 mm </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> PLGA bütünlüğünü ve farklı vakum saklama torbası Tablo 1. etkisi (50/50) membran (44 kg / mol), depolamadan 6 ay boyunca incelendi. Membran bütünlüğünün tamamen sağlam fiberler (+++) bazı Lif şişmesi olarak skorlandı (++), elyaf birleştirme (+) veya bozulmamış elyaf (-).

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration at JoVE.com

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

combination-microstereolithography-electrospinning-to-produce

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Görüntüleme.  University of Sheffield.  Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder. 

Video: Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Elektrospinning Temelleri: Optimizasyon Çözümü ve Cihazlar Parametreleri

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Biyomühendislik

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Bir Kombine Yüzey Tırnak ve Postmodification Süreci Işık duyarlı Membranların Hazırlanması

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Yan yana İyon Değişimi Membranlar arasında İyon Konsantrasyon Polarizasyon birleştirme Polarizasyon Bölgesi İlerlemesinin yasakla

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...