Polimikrobiyal sepsis için cekal bulamaç modeli benzersiz neonatal patofizyolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. Değişken olabilir ve insancıl uç noktalar iyi açıklanmamıştır. Burada bir cecal bulamaç hazırlamak ve deneysel hayvanlariçine enjekte etmek için son derece standart prosedürü sıyoruz.
Ayrıca, moribund yavrularını mümkün olan en erken zaman noktasında tanımlamak için veri odaklı bir yaklaşım kullanıyoruz. Dondurulmuş cecal bulamaç stoku hazırlayarak başlayalım. Bu, en az beş yetişkin fareden cecal concent havuzlama, steril dekstroz suyu askıya ve eksi 80 daha sonra kullanmak için depolama yapılır.
Erkek veya dişik kullanabilirsiniz, ancak deneylerinizde farelerin cinsiyeti, yaşı ve arka planı sabit tutulmalıdır. İlk olarak, diseksiyon için bizim araçları hazırlayalım. Bu cilt için makas ve forseps bir dizi ve iç organlar için ikinci bir set içerir.
Kullanmadan en az 30 dakika önce sıcak boncuk sterilizatörü açın. Aletleri %70 etanole batırın ve ardından en az bir dakika sıcak boncuk sterilizatöre batırın. % 70 etanol ile kağıt havlu bir paspas sprey, sonra diğer araçların sterilize kısmı dokunmadan sterilize araçları çıkarın.
Soğuması için kağıt havluüzerine yerleştirin. Fareleri biyolojik güvenlik kabininde inceleyin. Farenin karın kadar 23 gauge iğneler kullanarak bir strafor tahtası için farenin bacaklarını pin.
% 70 etanol ile karın sprey. Steril çiller ve makas kullanarak, deri ile kesilmiş, makas ile periton astar deri gevşetin ve göğüs kasık ve sol tarafında sağ tarafına dikdörtgen bir bölge açık kesti. Periton çevresindeki herhangi bir kürk çıkarın.
Periton kesmek için steril araçlar yeni bir çift geçiş, ayrıca dikdörtgen bir açılış yapma. Cecum tanımlayın, hangi vücut boyunca sol tarafında sağ tarafında çalışıyor olmalıdır. Bağırsaklardan çekum dalları tanımlamak ve bağırsaklardan uzak çekum kesmek için bağ dokusu bozun.
Sterilize edilmiş bir tartım kağıdına yerleştirin. Steril araçları kullanarak, çekumun her iki ucunu da kesin. Çekumun ortasını forceps ile tutun ve cecal içeriğini yavaşça bir yuvarlanma hareketi kullanarak uçlardan dışarı itmek için düz bir metal spatula kullanın.
İçeriği toplayın ve önceden tartılmış 15 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin. Aynı tüp içine en fazla beş fare havuz cecal içeriği. Tüm içerikler eklendikten sonra tüpü tekrar ağırlıklandırın.
Dekstroz suyunun hacmini hesaplamak için her tüpteki sekal içeriğine ekleyin, tüpteki sekal içeriğinin ağırlığını mililitre başına miligram cinsinden istediğiniz konsantrasyona bölün. Cecal içeriğinin yeniden askıya alınması için buz üzerinde dekstroz suyu aliquot tutun. Cecal içeriği içeren 15 mililitrelik centrifuge tüp için dekstroz suyu gerekli miktarda ekleyin.
Yaklaşık 30 saniye boyunca tüpü dikey ve yatay olarak girdaplayın. Çapı birkaç milimetre üzerinde partikül varlığı için gözlemlemek, ve varsa, tüm partikül gözle görülür kayboldu kadar girdap devam edin. Filtrasyon toplamak ve üst üzerinde steril bir 70 mikrometre hücresüz yüklemek için buz üzerinde 50 mililitrelik bir santrifüj tüp yerleştirin.
Pipet hücre süzgeci üzerinde bir 15 mililitrelik tüp ten ve toplama tüpü içine yeniden askıya bulamaç dört mililitre. 2-3 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak partikülü yeniden askıya alın. Filtrelenen sıvı kalmadan içindekileri pipet ucuyla karıştırırken filtreleme hızını artırmak için kabarcıkları hafifçe ekstrüzyonu.
Bu yaklaşık 30 saniye sürer. Cecal bulamaç her tüp arasında hücre süzgeçleri değiştirin, ancak aynı 50 mililitre toplama tüpü içine tüm içeriğini havuz. Stok40 mililitreyi aşarsa, 15 saniye boyunca girdap ve yeni bir santrifüj tüpü içine 20 mililitre yerleştirin.
Her biri 500 mikrolitre lik kriyojenik şişelere bulamacı bölün. Her üç şişe arasındaki bulamacı girdap. Ana stoku buzdaki şişelerde saklayın.
Eksi 80'de aliquots depolayarak, bir cekal bulamaç hazırlanmasında birim konsantrasyon oluşturan aerobik koloni altı aylık bir süre içinde değişmez. Şimdi cecal bulamaç hazırlanır, biz cecal bulamaç bir ağırlık ayarlanmış doz ile yedi ila sekiz günlük fareler in bir çöp meydan okumak için kullanabilirsiniz. Bulamacın öldürücülüğü doza bağlıdır.
Yeni bir doz titrasyon ile her yeni stok için tesisinde istenilen ölümcül dozu belirlemek zorunda kalacak. Bir cecal bulamaç enjeksiyon aliquot çöp başına hazırlanır. Inoculumu 100 mikrolitrelik bir hacimle normalleştiriyoruz, çöpteki her hayvan için en yakın 10 mikrolitreye yuvarlaıyoruz.
Meydan okuma aliquot hazırlanması üç hesaplamalar gerektirir, bulamaç stok hacmi gerekli, dekstroz su ek hacmi, ve çöp her yavru için yuvarlatılmış hacim. Her hesaplamanın nasıl gerçekleştirileceğinin ayrıntıları protokolün üçüncü bölümünde bulunabilir. Her deney için bu hesaplamaları elle yapmak zaman alıcı olabilir ve deneysel hataya katkıda bulunabilir, böylece stok konsantrasyonunuzu, istenilen dozu ve çöpünüzün ağırlığını ve bulamaç stokunun miktarı, dekstroz suyu hacmi ve yavru başına gerçek hacmiotomatik olarak iade ettiğiniz protokolle birlikte bir elektronik tablo indirilebilir.
Bu sayfayı yazdırıp hayvanlarınıza meydan okumaya hazır olduğunuzda da yanında götürebilirsiniz. Enjeksiyon aliquot'u biyolojik bir güvenlik kabininde hazırlayın ve buzda tutun. Şırıngayı yüklemeden önce, mikrosantrifüj tüpünü 20 kez hareket ettirerek karıştırın.
Yavrular 28 gauge insülin şırınga ile meydan okunur. Bulamaç hazırlamadan önce, ilham ve mikrocentrifuge tüp içinde ve dışında meydan aliquot 300 ila 500 mikrolitre çıkararak aliquot karıştırın. Sonra, meydan aliquot yaklaşık 150 mikrolitre çizin.
Bu herhangi bir yedi ila sekiz günlük yavru için enjeksiyon hacmi daha büyük olmalıdır. Dalgıç kabarcıkları çıkarmak için şırınga da flick ve herhangi bir hava kabarcıkları çıkarmak için şırınga biraz geri çekin. Bu işlem sırasında iğneye veya piston şaftına dokunmayın.
Fare için hesaplanan cecal bulamaç miktarı şırınga içine yüklenene kadar mikrocentrifuge tüp içine geri aşırı cecal bulamaç dağıtın. Çekal bulamacı intraperitoneal enjeksiyon ile uygulanır. Bunu hayvan bakım kurumundaki protokole göre gerçekleştirin.
Sızıntıları en aza indirmek için, yavruyu aşağı ya sayılsın ve iğneyi bacak ile cinsel organ arasına takın, iğneyi sığ ve deri altı olarak takın. İğneyi yaklaşık bir santimetre ye soktuktan sonra, iğnenin peritonu delinmiş olduğunu hissedene kadar aşağı ve ileri doğru bastırın, sonra yavaşça pistonu bastırın. Girdiğiniz rotayı takip ederek iğneyi dikkatlice çekin ve bunu yaparken orta parmağınızı gevşetin.
Laboratuvar defterinizdeki sızıntıları not edin ve nihai sonucunuzdan önemli sızıntılarla hayvanları atlamayı düşünün. Bu bölümde polimikrobiyal sepsis ile meydan farelerde gözlemlediğimiz farklı sağlık düzeylerini ve bunların insani bitiş noktasını ana hatlaşacağız. Yenidoğan fareleri içeren herhangi bir işlem için yatak malzemesini yeni bir kafese aktarıyoruz.
Bu, bayanın kokusunu eldivenlerinize aktarıyor ve kafesine tekrar tekrar girmesinden kaynaklanan kadın üzerindeki stresi azaltır. İzlenen yavruları prosedürün sonuna kadar tutmak ya da tüm çöpler kadın kafesine geri dönmeye hazır olduğunda izleme yapmak için yeni kafeste ikinci bir yuva yapıyoruz. Bir fareyi sırtına yerleştirin ve dört saniye içinde sağa dönebilme yeteneğini izleyin.
Eğer doğru olabilir, o zaman hareketlilik düzeyini belirlemek için sekiz saniye daha bekleyin. Rakipsiz veya kurtarışlı bir fare, genellikle üst üste birden çok adım atarak ortamını doğru ve keşfedebilir. Kendilerini haklı çıkarabilen ve çevresini hak sahibi olarak keşfetmek için birkaç adım atabilen fareleri yeniden gruplandırma.
Bu fareler bir adım atarken üzerine düşebilir ve ayakları üzerinde titrek görünebilir. Sağa dönememiş ve kalça hareketi yataydan 90 dereceyi aşan bir fare dir. Bu fare sonunda sağa dönecektir, ancak dört saniye içinde kullanılamaz.
Kalça hareketleri nedeniyle sağ mobil de başarısız olarak gruplandırılır. Sağa dönemeyen ve kalça hareketini yataydan 90 derecenin altında olan yavrular sağ-uyuşukolarak gruplandırılır. Bu, kalçaları yataydan 90 dereceyi geçmeyen ve sağ-uyuşuklukta başarısız olarak gruplanan bir farenin başka bir örneğidir.
Sağ-hareketsiz yavru başarısız sallamak veya titreşebilir ama kalça hareketi var bacaklar olacaktır. Ekstremiteler uzatılabilir ve geri çekilebilir ancak lateral hareket olmaz. Yavru gözle görülür derecede hasta ve insancıl bir son noktaya ulaştı.
Bu sağ-mobil olmayan yavru başarısız başka bir örnektir. Kalçaları soldan sağa sallamaz, ama pençeleri titreşir. Kadın kafesi ile çalışırken, emziren kadın koşarsa yavrular yuvadan dışarı sürüklenebilir.
Bunları değiştiriyoruz ve yuva arkadaşlarından uzakta olan diğer dağınık yavruları kontrol ediyoruz. Eğer bu dağınık yavrular sağ uyuşukluk ta başaramazlarsa, insancıl bir noktadalar. İşte sepsis modelimizin Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi.
İzleme zaman noktaları ekli SOP bulunabilir. Hayatta kalma eğrisi boyunca herhangi bir noktada bir fare sağ-nonmobile başarısız olduğu tespit edilirse, onun insancıl bitiş noktasında ve ötenazi olduğunu. 12 ila 21 saat sonra, fareler hasta görünür ve farelerin yaklaşık yarısı bir tarafta sağa, diğer yarısı ise yanlarında sağa başarısız olacaktır.
Bu, farelerin sağlık puanında digress ve sağ-nonmobile başarısız insancıl bitiş noktasına ulaşmak başlayacak zaman dilimidir. Bunlar bu zaman diliminde gözlenen sağlık puanlarının temsili sonuçlarıdır. Hayatta kalan ve hayatta kalan gruplar sağlık puanlarına göre bu noktada farklılaştırılamazlar.
Hastalığın bu evresinde, 21 ila 48 saat sonra, insancıl uç noktaların en yüksek oranını gözlemliyoruz. Ayrıca, her iki tarafta da sağa dönemeyen farelerin büyük çoğunluğunun hastalıktan kurtulamayacağını gözlemledik, bu da doğru mobil olmayan kriterlere ek olarak insancıl uç nokta için yeni bir kriter haline geliyor. Hastalığın bu evresinde gözlenen sağlık skorları, hayatta kalanların hayatta olmayanlardan ayrılmasıyla sonuçlandı.
Her iki tarafta da sağa dönemeden farelerin büyük çoğunluğu hastalıktan kurtulamadı. Bu veriler, 21 saat sonrası meydan okumadan başlayarak insancıl uç nokta için yeni bir kriterin, her iki tarafta da sağa yamayan fareleri ötenazi yemesi gerektiğini desteklemektedir. 48 saat sonra birçok fare daha fazla aktivite ve daha iyi bir düzeltme refleks görüntülemeye başlayacaktır.
Bu dönemde insancıl uç noktaların oranı daha düşük olsa da, fareler hala digress ve hasta hale gelebilir, ve yine de insancıl uç noktası için izleme gerektirir. Bu zaman diliminde, hayatta kalan olmayan fareler olarak gruplandırılan farelerden bazıları bir noktada artan aktivite göstermiş, ancak daha sonra daha kötüsünü göstermiş ve insancıl bir bitiş noktasına ulaşmıştır. Bu, daha kötü sağlık sonuçları göstermeye başlarlarsa, hasta hayvanların sıklığı nın artmasıyla sürekli izlenmesini gerektirir.
Şahsen eğitim almamış ve sadece bu öğretim videosunu gözlemleyen bağımsız deneyciler, kayıtlı test videolarını kullanarak araştırmacılarla aynı puanı atama yetenekleri açısından test edildi. Bu öğretim videosu doğru davranış sınıflandırması ile sonuçlanır. İnsancıl uç noktanın bir ölçüsü olan doğru mobil olmayan neonatal farelere doğru skoru atama yeteneği 60 yenidoğan fareden belirlendi ve davranışların ortalama %97'si doğru olarak ayırt edildi ve sadece %3'ü yanlış tanımlandı.
Daha sonra, doğru ya da dört saniye içinde doğru başardık neonatal fareler ayırt yeteneği test edildi. Bu insancıl uç noktanın başka bir ölçüsüdür ve doğru neonatal farelerin% 97 atandı, yavruların% 3 yanlış doğru olarak atandı. Burada farelerin yüzde ağırlık değişimi için temsili sonuçlar meydan okuma zamanlarına göre vardır.
Hayatta kalanlar ve hayatta olmayanlar arasındaki ortalama ağırlık değişimi meydan okumadan 24 saat sonra ayrılmaya başladı, ancak gruplar arasında çok fazla örtüşme var. %20'den fazla kilo veren ama yine de hastalıktan kurtulanlar vardı. Ağırlık değişimi, sağlık skorları arasındaki farklılıklarla karşılaştırıldığında sonucu tahmin etmede o kadar etkili değildi, bu nedenle farelerin insancıl bir uç noktada olup olmadığını belirlemede kriter olarak kullanılmamaktadır.
Sonuç olarak, şimdi dondurulmuş cecal bulamaç bir stok hazırlamak gerekir, ağırlık ayarlı dozu hesaplamak. Ve insancıl uç noktalar için yeni doğan farelere enjekte edin ve izleyin. Bunun fare araştırmanız için değerli bir kaynak olacağını umuyoruz.
