Protokolümüz, deneysel bir neonatal sepsis modelinde bakteriyel yayma ve yük takibine ve hastalığın diğer belirteçlerini patojen yüküyle ilişkilendirebilme ye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, bireysel yenidoğan farelerde sepsisi uzunlamasına analiz etmemizi sağlayarak enfeksiyon dinamiklerini ve bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak gözlemleme ve karşılaştırma fırsatı sağlar. Yenidoğan sepsisi için girişimlerin klinik öncesi testleri bu yöntemle yapılabildiği gibi, bakterilerin konak kontrolünün etkilerinin izlenmesine olanak sağlar.
Bir biyogüvenlik seviyesi iki kabine içinde ya yüksek veya düşük doz çöp gruplarına yaş eşleşen yavru yerleştirerek başlayın. Doğum sonrası üçüncü veya dördüncü günde, aşılamadan önce tüm yavruların ağırlıklarını kaydedin. Biyogüvenlik kabininde PBS veya yüksek veya düşük doz E.coli lux inoculum ile insülin şırıngaları yükleyin ve yüklü şırıngaları buza yerleştirin.
Biyogüvenlik kabine içinde temiz bir yüzeye enjekte edilecek yenidoğan yerleştirin ve yavru scruff gibi boyun ense de deri yükseltmek. İğneyi deri ile kas arasında oluşturulan boşlukta derinin hemen altına yerleştirin. İğne deri altında hissedilebilir, aynı anda geri akışı önlemek için derinin kıstırılmış kısmını serbest ederken inoculant 50 mikrolitre enjekte, sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde iğne çıkarın.
Tüm yavrulara aynı şekilde enjekte edildiğinde, yavruları barajlarına geri döndürün. Enjeksiyondan hemen sonra ve bundan sonra uygun deneysel zaman noktalarında, E.coli lux enfekte yenidoğan fareler ve baraj ile kafesi biyogüvenlik seviyesi iki laminar akış başlığına yerleştirin ve yazılımı mikro BT bilgisayarında açın. Sistemi başlatmave sahne sıcaklığının 37 santigrat derecede kilitlenmesi ve CCD sıcaklığının negatif 90 santigrat derecede kilitlenmesi için bekledikten sonra, en fazla dört anestezili yavruyu eğilimli pozisyondaki görüntüleme odasına yerleştirin.
Görüntüleme odasının kapağını kapatın ve Lüminesans görüntüleme seçeneğini seçin. Filtreyi aç ve sonrayı seçin ve uyarma filtresini engelleyecek şekilde ayarlayın ve emisyon filtresini de açın. 500, 520, 560, 580, 600 ve 620 nanometre seçin.
Daha sonra anestezi iyileşene kadar izleyerek baraj ile kafese dönmeden önce yavruları görüntüleyin. Uygun deneysel uç noktada, bir biyogüvenlik kabinesinde, kontaminasyonu önlemek ve hayvanı sağ tarafına yerleştirmek için ötenazi yenisini %70 etanol ile aşındırın. Karın ve arka sol bacak arasındaki cildi kavramak için forceps kullanın ve bir deri kesi yapmak için ince ucu cerrahi makas kullanın.
Daha sonra tüm dalak açığa çıkana kadar hayvanın arkasına doğru kesi devam edin. Dalağını karından çıkarmak ve aşağı doğru uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirmek için forsepsleri ve makasları kullanın. Akciğerleri elde etmek için, göğüs derisi tamamen soyma ve göğüs kafesi bölünmüş kadar yukarı kesilmiş makas ile göğüs tabanına girerek.
Tek tek sağ ve sol akciğerleri kavramak ve torasik kavite akciğerleri kaldırmak için forceps kullanın. Kalp makasla akciğer dokusundan çıkar. Daha sonra akciğeri aşağı akım uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirin.
Bir in vitro bakteriyel öldürme tahlili gerçekleştirmek için, steril bir içinde 40 mikrometre naylon süzgeç içine 40 mikrometre naylon süzgeç içine yerleştirin 10% fetal sığır serum ile desteklenen PBS beş mililitre içeren 60 milimetre Petri çanak ve tek bir hücre süspansiyon içine doku ayrıştırmak için steril üç mililitreşyon şırınga piston kullanın. Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj ile toplayın. Üç ila dört dalak başına kırmızı kan hücresi lisis tampon bir mililitre pelet resuspend.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, PBS dalak yıkayın ve pbs 250 mikrolitre sığır serum albumin ve sayma için iki milimolar EDTA ile birlikte pelet resuspend. Daha sonra, üreticiprotokolüne göre uygun immünomanyetik boncuklar ile Ly6 B2 pozitif hücreleri izole ve bir kez zenginleştirilmiş Ly6 B2 pozitif hücreleri tohum bir kez 10 siyah veya beyaz 96-iyi plaka iyi yoğunluk başına tam orta 100 mikrolitre başına beş hücre. Her kuyuda 100 mikrolitrelik son bir hacimde bakteriin inokülü istenilen sayıda hazırlayın ve hücre kültürü kuluçka sında bir saatlik kuluçka için her kuyuya tek başına 100 mikrolitre bakteriyel inokül veya orta ekleyin.
Kuluçka sonunda, kalan hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve hücreleri iki saat daha hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürmek için mililitre başına 100 mikrogram gentamisin ile takviye edilmiş 200 mikrolitre taze tam ortam ile orta yı değiştirin. Kuluçka sonunda ve bundan sonraki her deneysel zaman noktasında, bir sonraki okuma kadar hücre kültürü kuluçka için plaka dönmeden önce kapaklı kültür plaka her kuyuda parlaklık ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Çoğu hayvan enfeksiyon sonrası 24 saat kanda yüksek düzeyde bakteri sergilerken, bazı yavrularda kanda düşük veya tespit edilemeyen bakteriler vardır, bu da enfeksiyonun bu zaman noktasına kadar temizlenebildiğini düşündürmektedir.
Buna ek olarak, ekstrasellüler bakterilerin çıkarılması ndan önce bir saat boyunca biyolüminesans E.coli ile enfekte olan neonatal Ly6 B2 pozitif dalak hücreleri ve müteakip gentamisin tedavisi, üç saat içinde yüksek düzeyde parlaklık ifade etti ve bu da zamanla bakteriyel açıklık göstergesidir. Parlak bakterilerin canlı hayvan görüntülemesi, enfeksiyon sonrası 10 ve 24 saat içinde yenidoğan yavrularında bakteri yayılması ve büyümesindeki artışı daha da doğrular. Mikro BT ile birlikte intravital görüntüleme beyin içinde enfeksiyon foci belirlenmesini kolaylaştırır, akciğerler, ve diğer periferik dokular.
Bazı yüksek enfekte farelerin akciğerleri, parlak bakteri sinyallerine eş lokalize inflamatuar konsolidasyon ile uyumlu opak bölgeler gösterir. Enfekte olmayan kontrol akciğerlerinde inflamatuar eksüda olduğu tahmin edilen bu bölgelergözlenmez. Kontrollere göre inflamatuar sitokin ekspresyonunda da belirgin bir artış gözlenir, alveoler duvarın belirgin kalınlaşma ile ilişkili hem düşük hem de yüksek inokül grupları, artmış alveoler kanama, ve bu hayvanlarda inflamatuar infiltrasyon.
Unutulmaması gereken en önemli şey enjeksiyonları yaparken uygun tekniği uygulamak ve anestezi yi uygularken neonatlara sıkı dikkat etmektir. Bu tekniği kullanarak, girişimleri incelemek için neonatal sepsisi gerçek zamanlı olarak görselleştirebilir ve immün yanıtı iyileştirmeye yönelik tedavilere ev sahipliği yapabiliriz.
