Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01 AI163333] tarafından CMR'ye desteklenmiştir. West Virginia Üniversitesi Akış Sitometrisi ve Tek Hücreli Çekirdek Tesisine aşağıdaki hibelerle sağlanan ek finansman desteğini kabul ediyoruz: WV CTSI hibe GM104942, Tümör Mikroçevre CoBRE hibe GM121322 ve NIH hibe OD016165.

Tüm prosedürler Batı Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyelerine göre gerçekleştirildi. Bu çalışma için C57BL/6J fare yavruları kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Medya hazırlığı
<ol><li>5 mL'lik bir santrifüj tüpünde% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 3 mL MEM kültür ortamı hazırlayın ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Kemik iliği progenitörlerini sıvı nitrojen içinde saklamak için gerekirse,% 10 DMEM,% 80 FBS ve% 10 DMSO içeren dondurma ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Tam DMEM için,% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.</li>
	<li>Makrofaj farklılaşması için,% 10 FBS, 2 mM glutamin, penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ve% 10 L929 hücreli süpernatant 9,10,11 ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.</li>
</ol>2. L929 hücreli süpernatan hazırlığı
<ol><li>Sıvı nitrojen içinde depolanan L929 hücrelerini çözün ve 5 mL tam DMEM içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 mL tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bunları 2×105 hücre yoğunluğunda bir T25 doku kültürü şişesine tohumlayın. % 0.4 tripan mavisi kullanarak otomatik bir hücre sayacı ile hücreleri sayın. 37 ° C'de% 5 CO2 ile% 70 birleşme noktasına ulaşana kadar inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri ayırmak için önce 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 2.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile değiştirin.</li>
	<li>37 ° C'de% 5 CO2 ile 5 dakika inkübe edin ve 5 mL tam DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini 15 mL tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bir T75 şişesine aktarın.</li>
	<li>Hücreler% 90 birleşmeye ulaşana kadar% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra ortamı toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. M-CSF içeren ortamı 0,45 μm'lik bir filtreden süzün ve -80 °C'de 5 mL'lik alikotlarda dondurun.</li>
</ol>3. Hayvan hazırlama
<ol><li>Bir biyogüvenlik kabini altında, 7-9 günlük C57BL/6J fare yavrularını (6 yavrudan oluşan bir çöp) barajdan dikkatlice ayırın ve ayrı bir kafese koyun.</li>
	<li>Bir pamuğu 2 mL veterinerlik sınıfı izofluran içinde bir çan kavanozuna veya başka bir muhafaza odasına batırın.</li>
	<li>Hazneye bir yavru yerleştirin ve kapağı kapatın. Hareketsiz ve bilinçsiz hale geldiğinden emin olmak için yenidoğanı yaklaşık 90 saniye izleyin.</li>
	<li>Yavru bilincini geri kazanmadan önce yavruyu hızla çıkarın ve keskin bir makasla (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) kafasını kesin. NOT: Yenidoğanlar, tek başına izofluran inhalasyonu ile ötenazi için yeterince derin nefes almazlar.</li>
	<li>Her yavru çıkarıldıktan sonra kabın kapağını kapattığınızdan emin olun. Aynı pamuk topu 5-7 yavru için de kullanılabilir.</li>
</ol>4. Yenidoğan kemik iliği izolasyonu
<ol><li>Yenidoğanın vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin.</li>
	<li>"Forseps ve ince uçlu cerrahi makas kullanarak, aralarına bir kesi yapın. karın ve arka bacaklar. Arka bacakların ayağına doğru çekerek cildi çıkarın.</li>
	<li>Keskin kenarlı forseps kullanarak kemiklere bağlı bağ dokusunu ve kasları kazıyın.</li>
	<li>Tibia ve uyluk kemiğini Şekil 1'de gösterildiği gibi ayırmak ve çıkarmak için makasla kesin. Forseps kullanarak, bu kemikleri buz üzerindeki medya tüpüne yerleştirin. Her yavru için işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Kemikleri forseps yardımıyla toplama tüpü olan 40 μm'lik bir süzgecin içine aktarın. Kemikleri ezin ve süzgecin üzerine 3 mL'lik bir şırınga pistonu ile bastırarak iliği serbest bırakın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 350 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve eritrositlerin parçalanması için hipotonik bir çözelti olan% 0.2 NaCl'de hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden süspanse edin. Çözeltiyi izotonik hale getirmek için hemen% 1.6 NaCl eşit hacimde ekleyin.</li>
	<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve lizis çözeltisini çıkarın.</li>
	<li>Hemen kullanım için tam DMEM'de yeniden askıya alın veya depolama için dondurma ortamı ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. NOT: Bu çalışmada bu yöntemle 6.55 (± 1.44) × 106 kemik iliği hücresi/yavru elde edilmiştir (Şekil 1E).</li>
	<li>Hücreleri -80 °C'de dondurucu ortamda saklayın veya aşağıda açıklandığı gibi hemen kullanın. NOT: Yaş nedeniyle, kemikler içlerinden iliği görselleştirecek kadar şeffaf ve berraktır. Kemikleri çekerken dikkatli olmak önemlidir çünkü üzerlerine hafif bir baskı uygulamak iliği serbest bırakmak için yeterli olabilir. Yenidoğan kemiklerindeki ilik, yetişkin kemiklerinde bulunan sağlam bir iplikten ziyade sıvı formundadır. Kemiklerin toplanması sırasında kaçarsa iliği toplamak zordur.</li>
</ol>5. Neonatal kemik iliği kaynaklı makrofajların farklılaşması
<ol><li>M-CSF kaynağı olarak% 10 L929 hücreli süpernatant (2.5 mL) içeren 10 mL tam DMEM'de T75 şişesi başına 2 ×10 7 kemik iliği hücresi tohumu. Kültür kaplarını 37 °C'de% 5 CO2 ile 5 gün boyunca inkübe edin. Farklılaşmanın 3. gününde 2 mL L929 şartlandırılmış ortam ekleyin.</li>
	<li>Ters çevrilmiş bir mikroskop ve 20x büyütmeli görüntüleme sistemi kullanarak hücreleri günlük olarak mikroskop altında gözlemleyin. Farklılaşma üzerine, makrofajlar yapışık, uzamış ve heterojen görünmelidir (Şekil 2).</li>
	<li>Aşağı akış tahlilleri için makrofajları hasat etmek için, farklılaşma ortamını aspire edin.</li>
	<li>Yapışmayan hücreleri ve ayrılmaya müdahale edecek serum proteinlerini çıkarmak için hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin.</li>
	<li>Şişeye 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin. Kültür şişesini 5 dakika boyunca% 5 CO2 inkübatörü ile 37 ° C'ye yerleştirin ve 5 mL DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri ayırmak için pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini 1 mL tam DMEM'de ayırın ve tripan mavisi kullanarak hücre canlılığını sayın ve kontrol edin. Bu yöntem kullanılarak izole edilen BMDM'ler 7.05 (± 2.52) ×105 hücre/yavrudur (Şekil 1E). NOT: Farklılaşmanın ikinci gününde ortaya çıkmaya başlayan mil şeklindeki hücrelerin varlığını gözlemleyin (Şekil 1B, kırmızı oklar). Ortamın rengi sararır ve harcandığını gösterirse, farklılaştırmanın 4. gününde daha fazla L929 koşullu ortam ekleyin; Ortamın tamamen değiştirilmesi önerilmez.</li>
</ol>6. İmmünoetiketleme ve akış sitometrik analizi
<ol><li>100 μL/etiket akış sitometrisi tamponu (2 mM EDTA ve% 0.5 sığır serum albümini ile desteklenmiş PBS) hacminde üretici tavsiyelerine göre 10 μL /10 7 hücreli FcR bloke edici reaktif ile muamele ederek BMDM'lerin spesifik olmayan antikor etiketlemesini (2x105 / etiket) bloke edin. 10 dakika buz üzerinde tutun. NOT: Hücreler toplu olarak veya tek tek kuyucuklarda veya tüplerde bloke edilebilir. Sonraki tüm adımlar, 100 μL'lik bir nihai hacimde tek tek hücre işaretleyici etiketi başına miktarları ve hacimleri gösterir.</li>
	<li>200 μL akış sitometrisi tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücreleri, oyuk başına 5 × 105 hücre yoğunluğunda U-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 100 μL akış sitometrisi tamponunda 3.000 kat ve 0.625 μL BV786-CD11b, PE-F4/80 ve AlexaFluor488-CD206'ya seyreltilmiş FVS780-Canlı / Ölü hücre sayma boyasını tek tek veya kombinasyon halinde ekleyerek hücreleri boyayın 12,13,14,15. Hücreleri folyo ile kaplı buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.</li>
	<li>100 μL akış sitometrisi tamponu ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleyerek yıkayın.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini nazikçe girdaplayın. Her oyuğa 100 μL% 0.4 paraformaldehit ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>100 μL akış sitometrisi tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleme ile pelet yapın.</li>
	<li>Hücreleri 400 μL akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.</li>
</ol>7. Yenidoğan kemik iliği kaynaklı makrofajların fagositik etkinliğini değerlendirmek için in vitro test
<ol><li>BMDM'leri fenol kırmızısı veya antibiyotik olmadan tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve 500 μL hacminde 35 mm'lik bir dörtlü tabakta 2 ×10 5 / kadran yoğunluğunda tohumlayın.</li>
	<li>Bakteriyel inokulumu 25 ° C'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) veya istenen başka bir MOI'de hazırlamak için, -80 ° C'de saklanan önceden hesaplanmış bir Escherichia coli O1: K1: H7 stoğunu çıkarın.</li>
	<li>İstenilen bakteri hacmini 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Toplam 1 mL hacme PBS ekleyerek bakterileri yıkayın. Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyerek peletleyin. Yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Bakteri peletini 50 μL PBS içinde yeniden süspanse edin ve 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona yeşil floresan pH'a duyarlı boya ekleyin. Bu, nötr pH'ta floresan sinyali olmayan pH'a duyarlı bir boyadır ve fagositoz işlemi sırasında asitlenmiş fagozomlar gibi asidik ortamlarda parlak bir şekilde floresan verir.</li>
	<li>Boya konjugasyonu için bakteri hücrelerini karanlıkta 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 × g'da santrifüjleme ile 1 mL PBS ile dört kez yıkayın.</li>
	<li>Bakterileri fenol kırmızısı olmadan 500 μL tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve BMDM kültürlerine ekleyin.</li>
	<li>BMDM'leri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 4 saat inkübe edin ve ardından lizozomları lekeleyen 200 ng hücre geçirgen kırmızı floresan boya ekleyin. NOT: Fagositik bakteriler floresan mikroskobu ile görüntülenebilir.</li>
</ol>

Neonatal Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Fagositik Test ile Değerlendirilmesi 

<ol>
	<li>Lucas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+bone+marrow+and+its+role+in+hematopoiesis.">Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).</li><li>Deb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+stem+cells+turn+into+bone+and+fat.">How stem cells turn into bone and fat.</a> N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+Aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Soleimani, M., Nadri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).</li><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+hematopoietic+growth+factors.">Lineage-specific hematopoietic growth factors.</a> N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Smith, A. M., Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+to+enhance+global+drug+development+in+neonates.">Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates.</a> Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).</li><li>Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+trials+for+children+and+young+people.">Challenges in clinical trials for children and young people.</a> Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).</li><li>Heap, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+the+L929+cell+supernatant+and+its+role+in+BMDM+differentiation.">Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation.</a> Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).</li><li>Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+bone+marrow-derived+macrophages+from+mice.">Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.</a> J Vis Exp. (196), e64566 (2023).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+An+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-1:+A+macrophage+differentiation+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody.</a> Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).</li><li>Austyn, J. M., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F4/80,+a+monoclonal+antibody+directed+specifically+against+the+mouse+macrophage.">F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage.</a> Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).</li><li>Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+murine+CD68++CCR2++and+CD68++CD206++lung+macrophages+in+acute+pancreatitis-associated+acute+lung+injury.">Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury.</a> PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).</li><li>Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+physiological+and+pathological+pregnancy.">Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy.</a> Front Immunol. 10, 792 (2019).</li><li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CD11c+defines+two+types+of+tissue-resident+macrophages+with+different+origins+in+steady-state+salivary+glands.">Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands.</a> Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).</li><li>Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowing+the+immaturity+myth:+The+cost+of+defending+from+neonatal+infectious+disease.">Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease.</a> Front Immunol. 9, 1077 (2018).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+newborn+and+young+infant+from+infectious+diseases:+Lessons+from+immune+ontogeny.">Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny.</a> Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).</li><li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors.">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).</li><li>Winterberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+phenotypic+features+of+neonatal+murine+macrophages).">Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages).</a> Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).</li><li>de Brito Monteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-+and+L929-derived+macrophages+present+distinct+metabolic+profiles+with+similar+inflammatory+outcomes.">M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes.</a> Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).</li></ol>

Yazarların bu makaleyle ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yenidoğan fare modellerini içeren araştırmalar bir takım zorluklar ortaya çıkarabilir. Yenidoğanlar, yetişkinlere kıyasla benzersiz olan gelişmekte olan bir bağışıklık sistemine sahiptir8. Bu nedenle, yetişkin hayvan modellerinden elde edilen verilerin yenidoğanlar için geçerli olduğu varsayılmamalıdır ve yayınlanmış birkaç çalışma bu fikri iyi bir şekilde ifade etmiştir18,19. Bu nedenle, erken yaşam bağ?...

Kemik iliği, kendi kendini yenileyebilen ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen hem hematopoetik hem de mezenkimal kök hücre popülasyonlarını kapsar. Kemik iliğindeki hematopoetik kök hücreler miyeloid ve lenfoid soylara yol açar1. Mezenkimal kök hücreler osteoblastlar (kemik), adipositler (yağ) veya kondrositler (kıkırdak) üretir2. Bu hücrelerin, gen terapisi 3,4 dahil olmak üzere hücre biyolojisi ve doku mühendisliği alanında birçok uygulaması vardır. Kemik iliğinde bulunan progenitör hücreler, soya özgü büyüme faktörlerinin varlığında spesifik hücre tiplerine farklılaşır. Eritropoietin, eritroid progenitör hücrelerin proliferasyonunu teşvik eder, granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), nötrofil kolonilerinin büyümesini uyarır ve trombopoietin, soya özgü büyüme faktörlerinin birkaç örneği olarak trombosit üretimini düzenler5. FACS ve manyetik ile aktive edilmiş hücre sınıflandırma (MACS) işaretli hücre yüzeyi antijeni, spesifik kemik iliği türevli hücre tiplerininizolasyonu ve saflaştırılması için iyi bilinen yöntemlerdir 6.
Yenidoğan çalışmaları, yenidoğan ölümlerinin nedenlerini bulmaya ve prematüre doğumlar sırasındaki komplikasyonları ele almaya doğru ilerlemesine rağmen, doğrudan terapötik gelişim karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Smith ve Davis, "Pediatrik hastalar terapötik yetimler olmaya devam ediyor" dedi7. Yenidoğanların klinik çalışmalarında küçük örnekler, sonucun yaşam boyu etkileri ve onam almada etik sorunlar gibi çeşitli zorluklar vardır8. Bu nedenle, translasyonel alaka düzeyini elde etmek için yenidoğanlara özgü in vivo ve in vitro çalışma modellerine yüksek talep vardır. Anatomik ve doku seviyeleri, kısa gebelik süreleri ve altlık boyutları arasındaki benzerlikler nedeniyle, kemirgenler en çok çalışılan memeli model sistemidir.
Burada, 7-9 günlük fare yavrularından kemik iliğini izole etmek ve makrofajlara farklılaşma yeteneklerini belirlemek için ayrıntılı, oldukça uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir prosedürü açıklıyoruz. Bununla birlikte, farklı farklılaşma sinyallerinin kullanılmasıyla çeşitli hücre soyları elde edilebilir. Ayrıca hücre yüzey belirteçlerinin varlığını ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler) için beklenen in vitro fagositik aktivitenin varlığını da gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round (U) bottom plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-65</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b-BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740861</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>141709</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565410</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSI-C3ACC</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>11775</td>
			<td>Infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-563-649</td>
			<td>Cell Imaging System&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>76419-584</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBright BMDM</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Dye free culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-929</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Flowcytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysotracker red DND 99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-010-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin /streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo green STP ester&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35369</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Cell star</td>
			<td>658170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300120</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>P20GM103434</td>
			<td>Confocal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal mouse bone marrow isolation and preparation of bone marrow-derived macrophages

Yetişkin farelerden kemik iliğini izole etmek için çeşitli teknikler iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, yenidoğan farelerinden kemik iliğini izole etmek zor ve zaman alıcıdır, ancak bazı modeller için translasyonel olarak ilgili ve gereklidir. Bu protokol, 7-9 günlük yavrulardan kemik iliği hücrelerini hazırlamak için etkili ve basit bir yöntemi tanımlar. Bu hücreler daha sonra daha fazla izole edilebilir veya ilgilenilen spesifik hücre tiplerine farklılaştırılabilir. Makrofajlar, iltihaplanma ve enfeksiyonda önemli bir rol oynayan çok önemli bağışıklık hücreleridir. Gelişim sırasında, neonatal makrofajlar dokunun yeniden şekillenmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, neonatal makrofajların fenotipi ve işlevleri yetişkin meslektaşlarından farklıdır. Bu protokol aynı zamanda L929 şartlandırılmış besiyerinin varlığında neonatal makrofajların izole kemik iliği hücrelerinden farklılaşmasını da ana hatlarıyla belirtir. Diferansiye neonatal makrofajlar için yüzey belirteçleri akış sitometrik analizi kullanılarak değerlendirildi. İşlevselliği göstermek için, fagositik verimlilik ayrıca pH'a duyarlı boya konjuge Escherichia coli kullanılarak test edildi.

Bone marrow encloses both hematopoietic and mesenchymal stem cell populations that are self-renewable and can be differentiated into various cell lineages.&#160;Hematopoietic stem cells in the bone marrow give rise to myeloid and lymphoid lineages1. Mesenchymal stem cells produce osteoblasts (bone), adipocytes (fat), or chondrocytes (cartilage)2. These cells have multiple applications in the field of cell biology and tissue engineering, including gene therapy3,4. Progenitor cells present in the bone marrow differentiate into specific cell types in the presence of lineage-specific growth factors. Erythropoietin promotes the proliferation of erythroid progenitor cells, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) stimulates the growth of neutrophil colonies, and thrombopoietin regulates the production of platelets as a few examples of lineage-specific growth factors5. Cell surface antigen labeled FACS and magnetic-activated cell sorting (MACS) are well-established methods for isolation and purification of the specific bone marrow-derived cell types6.
Though neonatal studies are advancing toward finding the causes of neonatal deaths and addressing the complications during premature births, direct therapeutic development remains an unmet medical need. Smith and Davis stated, &#34;Pediatric patients remain therapeutic orphans&#34;7. There are several challenges, such as small samples, lifelong effects of the outcome, and ethical issues in obtaining consent in clinical studies of neonates8. Hence, there is a high demand for in vivo and in vitro study models specific to neonates to achieve translational relevance. Because of the similarities between anatomical and tissue levels, short gestational periods, and litter sizes, rodents are the most studied mammalian model system.
Here, we describe a detailed, highly feasible, and reproducible procedure for isolating bone marrow from 7-9-day-old mouse pups and their ability to differentiate into macrophages. However, a variety of cell lineages could be achieved with the use of distinct differentiation signals. We also demonstrate the presence of cell surface markers and the presence of in vitro phagocytic activity expected for bone marrow-derived macrophages (BMDMs).

Yazar Spotlight: Erken Yaşam Bağışıklık Tepkilerini İlerletmek için Yenidoğan Farelerinden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajları İzole Etmek İçin Tekrarlanabilir Bir Yöntem Geliştirme

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Bu çalışmada özetlenen yöntemi kullanarak, 25 ila 37 milyon kemik iliği hücresi, beş C57BL / 6 fare yavrusunun çöp boyutundan başarılı bir şekilde izole edilebilir. Bu yöntem, 5 ila 7 yavru arasında değişen çöp boyutları ile doğrulanmıştır. Deneylerimizde minimum izolasyon yaşı 7 gündür. Çöp boyutuna ve deney için gereken hücre sayısının bir milyondan az olmasına bağlı olarak, araştırmacılar bu protokolü 7 günlükten küçük fareler için deneyebilirler. M-CSF kaynağı olarak...

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Bu çalışmanın kapsamı, bakteriyel enfeksiyona karşı erken yaşam bağışıklık tepkisindeki bazı sınırlamaları anlamaktır. Bunu başarmak için yenidoğanlara özgü araştırma modelleri geliştirmemiz ve kullanmamız gerekiyor. Yedi günlük bir yavrudan kemik iliğinin izolasyonu zordur ve iyi bilinmemiştir.Neonatal kemik iliği kaynaklı makrofajlar, diğer KMY'lerle karşılaştırıldığında hassas ve strese yatkındır. Bu protokolde kullanılan teknik basit ve tekrarlanabilirdir. Bu yöntem, kullanıcılara herhangi bir enzim kullanmadan yedi ila dokuz günlük yenidoğan farelerden kemik iliğini izole etmede rehberlik eder.Bu çalışma, neonatal farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajlar üretmek için neonatal immünoloji ile ilgili soruları ele almak için kullanılabilecek standart bir strateji sunmaktadır. Bu tekrarlanabilir yöntem, birçok uzmanlık alanında yenidoğan bağışıklık araştırmalarını ilerletmek için yaşa özgü bir model sağlar.

neonatal-mouse-bone-marrow-isolation-preparation-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

1.1K Görüntüleme.  West Virginia University School of Medicine. Bu çalışmanın kapsamı, bakteriyel enfeksiyona karşı erken yaşam bağışıklık tepkisindeki bazı sınırlamaları anlamaktır. Bunu başarmak için yenidoğanlara özgü araştırma modelleri geliştirmemiz ve kullanmamız gerekiyor. Yedi günlük bir yavrudan kemik iliğinin izolasyonu zordur ve iyi bilinmemiştir.Neonatal kemik iliği kaynaklı makrofajlar, diğer KMY'lerle karşılaştırıldığında hassas ve strese yatkındır. Bu protokolde kullanılan teknik basit ve ...

Video: Yazar Spotlight: Erken Yaşam Bağışıklık Tepkilerini İlerletmek için Yenidoğan Farelerinden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajları İzole Etmek İçin Tekrarlanabilir Bir Yöntem Geliştirme

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.