Bu yöntem, protein lokalizasyonu ve fotosentetik organizmaların dinamiği ile ilgili anahtar soruların cevaplandırılmasına yardımcı olabilir. Fotobeyaztma yöntemini süper çözünürlüklü mikroskopla birleştirerek, fotosentetik organizmaların protein dinamiklerini dikkate değer bir ayrıntıyla tespit edebiliyoruz. Bu yöntem sadece Prochlorococcus'un protein dinamikleri hakkında bilgi sağlar.
Ayrıca radyo-re-dop-sing ve bakteriyoklorofil içeren diğer birçok organizmaya uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren Yanxin Liu, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Başlamak için, bir kültür şişesine beş mililitre deniz suyu bazlı Pro99 ortamı ekleyin ve bir mililitre Prochlorococcus MED4 ile aşılamak.
Metrekare başına 35 mikromol foton yoğunluğu ile bir ışık altında 23 santigrat derece Prochlorococcus büyümek. Beş gün sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp içine kültür bir mililitre toplamak. Kültürü düzeltmek için tüpe 100 mikrolitre taze hazırlanmış formaldehit ekleyin.
20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Daha sonra, bir dakika için 13, 500 kez G örnek aşağı spin. Supernatant çıkarın ve Pro99 orta 100 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
İmmünoboyama yapmaya hazır olana kadar numuneyi karanlıkta dört derecede saklayın. İlk olarak, polistiren boncuk şişe girdap. %50 etanol kullanarak, çalışan bir bulamaç olarak bir-20, 000 seyreltme hazırlayın.
Ocaktabelasını açın ve sıcaklığı 120 dereceye ayarlayın. Daha sonra, kapaklar sıcak plaka üzerine yerleştirin. Her bir kapak kapağına 100 mikrolitre iş bulamacı yükleyin ve kapak dudaklarını 10 dakika boyunca ocakta kuluçkaya yatırın.
Daha sonra kapaklarını oda sıcaklığında saklanmak üzere dikkatlice Petri yemeklerine ad-side aktarın. Kapakları kaplamaya hazır olduğunuzda, boncuk tarafı yukarı olduğundan emin olmak için bir tane alın. Kapak kaymamerkezi mililitre poli-L-lizin çözeltisi başına bir miligram 100 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında oturup bekleyin.
Bundan sonra, herhangi bir bekar poli-L-lizin dikkatle aspire ve 1.5 mililitrelik bir tüp aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra kullanmak üzere bu poli-L-lizini dört santigrat derecede saklayın. 60 milimetrelik petri kabında 10 mililitre ultra filtrelenmiş su yla kapağı durulayın ve kağıt havluyla kısa bir süre kurulayın.
Kaplamalı kapak kapağını alt kısmında Parafilm olan yeni bir Petri kabına aktarın ve bu kabı boyama kabı olarak kullanılacaktır. Sabit numunenin 100 mikrolitresini coverslip'e yükleyin ve hücre ekine izin vermek için 30 dakika boyunca oturun. Daha sonra, kalan çözeltiyi emmek için bir kağıt havlu kullanın ve daha sonra yıkama için 12 kuyulu bir tabakta bir kuyuya kapak kayma aktarın.
Kapak kaymayı yıkamak için kuyuya bir mililitre PBS tampon ekleyin. Sonra PBS çıkarın ve ikinci kez coverslip yıkamak için taze PBS bir mililitre ekleyin. PBS kaldırmak ve taze hazırlanmış permeabilizasyon tampon bir mililitre ile değiştirmek için bir pipet kullanın.
Çamaşır kabını 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra permeabilization tampon kaldırın. Bir mililitre taze PBS tampon u ekleyerek yıkama işlemine başlayın.
Yavaşça beş dakika boyunca çanak ajite bir shaker üzerine yıkama çanak yerleştirin. Bundan sonra, PBS çıkarın ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Yıkanmış kapak kaymasını boyama kabına aktarın.
Coverslip üstüne engelleme tampon 50 mikrolitre ekleyin. Buz üzerine tüm boyama çanak yerleştirin ve sonra en az 60 dakika fotobeyazrlama için xenon ışık kaynağı altında hareket ettirin. Fotobeyaztma ve engelleme den sonra, engelleme tamponu kaldırmak için kağıt havlu kenarını kullanın.
İlk olarak, bir mikrolitre anti-FtsZ antikorını 99 mikrolitre lik tampon tamponu seyreltin. Seyreltilmiş primer antikordan 50 mikrolitreyi kapak kaymasıüzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kapak kapağını bulaşık kabının kuyuya aktarın.
Yıkamaya başlamak için bir mililitre PBS ekleyin. Sonra bir shaker için yıkama çanak aktarın ve yavaşça beş dakika sallayın. PBS'yi çıkarın ve tüm yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
Daha sonra, örtüyü boyama kabına aktarın. Seyreltilmiş sekonder antikordan 50 mikrolitreyi kapağın üzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca karanlıkta ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kapak kapağını yıkama kabına geri aktarın.
Yıkamaya başlamak için bir mililitre PBS ekleyin. Çamaşır kabını ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Plakayı çalkalayıcıya aktarın ve beş dakika hafifçe sallayın.
PBS'yi çıkarın ve tüm yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. STORM görüntülemeden hemen önce, metin protokolünde belirtildiği gibi bir mililitre görüntüleme arabelleği hazırlayın. Kapak kapağını yükleme odasına yükleyin.
Siyanobakteriyel hücrelerin yıkanmasını önlemek için nazik olmak, taze hazırlanmış görüntüleme tampon ekleyin. Bundan sonra, havadaki oksijenle tepkimesini önlemek için görüntüleme tamponunun üzerine dikdörtgen bir kapak kaydırın. Kamerayı, LED ışığını ve lazeri açın ve STORM yazılımını açın.
Lensin üzerine yarım damla daldırma yağı ekleyin. Objektif lensin kapak kayması ile temas yaptığından emin olmak için hazneyi yükleyin. Ve sinyali 750 nanometrelazerle inceleyin.
Hem hücreleri hem de güvenilir işaretleri içeren bir örnek alan tanımlayın. Sonra örnek sürüklenen düzeltme için yazılım başlatın. 300'de kamera elektron çarpımı kazancı ve 30 milisaniyelik pozlama süresiyle referans olarak geniş dosyalanmış bir görüntü elde edin.
750 nanometre uyarma lazer yoğunluğunu santimetre kare başına yaklaşık 4,5 kilowatt'a yükseltin. Florofore'ler seyrek yanıp sönen bir desene dönüştükten sonra, 33 hertz'de 10.000 kare toplayarak bir süper çözünürlüklü görüntü elde edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi ham verilerden süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturun.
Bu çalışmada, STORM stochastically bireysel fotoğraf değiştirilebilir floroforlar aktive ederek süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için kullanılır. Her floroforun konumu kaydedilir ve bu konumlara göre bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturulur. Prochlorococcus'un emilim spektrumları 447 ve 680 nanometrede zirve yaparken ve minimum emilime 700 nanometrenin üzerinde yken, Prochlorococcus MED4 hücreleri STORM görüntüleme için gerekli olan 750 nanometrelazerin son derece yüksek yoğunluğuna maruz kaldığında hala yüksek otofloresans yakımını sağlar.
Burada 30 dakika boyunca açıklanan fotobeyazrlama yöntemini kullandıktan sonra, otofloresansa sahip çeşitli hücreler hala tespit edilebilse de hücrelerin otofloresansının azaldığı görülmektedir. Fotobeyaztma işleminin 60 dakikaya uzaması, hücrelerin çoğunun otofloresansını kaybetmesine neden olur. Bu sonuçlar, geliştirilen fotobeyazlatma yönteminin fotosentetik organizmaların otofloresansını büyük ölçüde azaltabileceğini göstermektedir.
Fotobeyaztma sonra, STORM hücrelerde hücre bölünmesi protein, FtsZ, görselleştirmek için kullanılır. STORM kullanılarak FtsZ halkasının ayrıntılı morfolojisi ortaya çıktı. 3D STORM görüntülerini döndürerek, dört farklı morfoloji türü, kümeler, tamamlanmamış bir halka, tam bir halka ve çift halka lar tanımlanmıştı.
Bu ışık yoğunluğu ve fotobleach süresi farklı organizmalar için farklı olabilir hatırlamak önemlidir. Bu yöntem, geliştirildikten sonra fotosentetik hücrelerde protein organizasyonu ve potansiyel işlevini ayrıntılı olarak incelemek isteyen araştırmacıların önünü açıyor.
