Hibe: 5RO1GM086447-02.

1. Örnek Hazırlanması <ol><li> Suşu JB281 tek bir koloni ile LB ortamı aşılamak [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. 37 bir çalkalayıcı gecede büyümek ° C. </li><li> M9 içine kültür 1:1,000 + asgari medya [M9 Tuzlar,% 0.4 glikoz, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, MEM Amino Asitler ve Vitaminler] seyreltin ve orta-log fazı (= 0.2-0.3 OD 600) büyümek Oda sıcaklığında (RT) de kloramfenikol (150 ug / ml) varlığında. </li><li> 20 uM (Not # 1) 2 saat süreyle IPTG ile kültür øndükle. </li><li> Pelet mikrosantrifüj (8.000 rpm, 1 dak) ve kültür M9 + eşit hacimde tekrar süspansiyon haline getirin; tekrarlayın. Ikinci yeniden süspansiyon sonra 2 saat oda sıcaklığında büyüme devam etmektedir. </li><li> 40 dk için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehid (pH = 7.4) ile indüklenen kültür düzeltildi. PBS eşit hacimde Pelet kültür ve tekrar süspansiyon; tekrarlayın. Görüntüleme canlı hücreler varsa, eşit hacimde fiksasyon, pelet kültür ve tekrar süspansiyon atlayınM9 arasında - [M9 Tuzlar,% 0.4 glikoz, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, MEM Amino Asitler]; tekrarlayın. </li><li> Yeniden süspanse kültürü ile 1:10 altın boncuk seyreltin. (Adım 2.4) hazırlanmış görüntüleme odasına örnek uygulayın. </li></ol> [1] Not: Yukarıdaki indüksiyon protokol (adım 1.1-1.3) suşu JB281 ifade sistemi için optimize edilmiştir. Ayrıntılı indüksiyon koşullarında diğer ilgi ifade sistemleri veya proteinler için değişebilir. 2. Görüntüleme Odası Meclis <ol><li> - M9 içinde bir% 3 (w / v) solüsyonu agaroz edin. 40min bir tezgah üst ısıtma bloğu 70 agaroz ° C eritin. Mağaza kadar 5 saat için 50 ° C&#39;de agaroz eridi. </li><li> Aşağı bakacak şekilde elektrotlar ile görüntüleme odasının üst yarısında bir temiz microaqueduct slayt yerleştirin. Perfüzyon kanalları kapsayacak şekilde microaqueduct slaytta alt contasını. </li><li> Cam merkezine eritilmiş agaroz ~ 50 ul uygulaslayt. Temiz, kuru bir lamel ile hemen üst agaroz jel damlacık. Jel 30 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya bırakın. <ol><li> Lamelleri temizlemek için: bir seramik tutucu lamelleri düzenlemek ve aseton, etanol ve cam kavanozlarda 1M KOH banyoları dönen 20 dakika sonikasyon. DH 2 O., tek bir sonikasyon takiben, 9 sonications toplam döngüsü, üç kez tekrarlayın Taze dH 2 O içinde temizlenmiş lamelleri Mağaza Kullanmadan önce, filtrelenmiş hava ile kuru lamelleri darbe. </li></ol></li><li> Dikkatlice microaqueduct slayt üzerinde jel pedi bırakarak, lamel çıkarın. Hemen jel pedi üst hücre kültürü örnek 1 ul (adım 1.6 bakın). Çözüm jel pedi tarafından absorbe edilmesi için izin ~ 2 dakika bekleyin. Yeni, temiz, kuru lamel ile Top jel pedi. Üreticinin talimatlarına göre tüm görüntüleme odasının birleştirin. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Mikroskop, kamera ve lazer açın. MetaMorph yumuşak açmal (Moleküler Cihazlar). </li><li> Görüntüleme yolu uygun uyarma / emisyon filtresi (Şekil 1) yerleştirin. </li><li> Buna göre lazer güçler ve satın alma ayarları. <ol><li> 488-nm lazer = 15 mW (Not # 2) </li><li> 561-nm lazer = 75 mW </li><li> 405-nm lazer = 2 mW ± nötral yoğunluk filtresi (Not # 3) </li></ol></li><li> Tamamlayıcı sahne adaptör aracılığıyla aşamaya görüntüleme odasına kilitleyin. </li><li> Homojen üç lazerler ile aydınlatılan uygun bir görüntüleme bölgesi (100x100 piksel) atayın. </li><li> Hücreleri ve yakın konvansiyonel işaretleri (altın boncuk) ama örtüşmeyen her ikisini içeren bir örnek alan tanımlayın. </li><li> Lamel en yakın hücrelerin yüzeyi üzerinde odaklanma. 50 ms entegrasyon süresi ile bir aydınlık görüntü Edinme ve (Şekil 3Ai) örnek içine odağı 0,5 mikron taşıyın. </li><li> 488-n gelen vak&#39;aları ile topluluğu yeşil floresan görüntü Edinme<html> m lazer 50 ms entegral süre (Şekil 3Aii) kullanarak. </li><li> 405-nm ve 561 nm lazerler sürekli yanması ile kırmızı kanalda streaming video edinin. Sabit hücreler için, 50 ms çerçeve hızı her 1000 kare ~% 10 Rampalı 405-nm lazer gücü ile 20.000 kare (~ 17 dk toplam) toplam (Not # 4) için kullanılır. Canlı hücreler için, 10 ms çerçeve hızı sabit 405 nm lazer gücünde 3.000 kare (~ 30 toplam) toplam için kullanılır. </li><li> Hücrelerin alt yüzeyine odak geri hareket ettirmek ve aşama 3.7 &#39;de olduğu gibi başka bir aydınlık alan görüntü alma. </li></ol> [2] Not: bir hücrenin yeşil floresans yoğunluğunu entegre hücre içinde ifade FtsZ-mEos2 moleküllerinin toplam sayısıyla doğru orantılıdır. 488-nm uyarma ve güç elde etme topluluk floresan ayarlar göreli FtsZ-mEos2 çeşitli hücrelerde ifade seviyeleri karşılaştırıldığında, böylece tüm hücreler için sabit tutulmalıdır. ontent &quot;&gt; [3] Not:. sabit hücreler her bir molekülün kesin olarak tespit edilebilir, böylece yavaş bir aktivasyon oran elde etmek için yerinde Doğal Yoğunluk (ND) filtre (Şekil 1, optik bileşeni # 5) ile görüntülü bir kırınım-sınırlı bir alanda aynı anda aktif olan iki molekül bir düşük olasılık korurken görüntüleme, hücrelerin aktivasyonu oranını artırmak için yaşamak ne ND filtre kaldırılır. hızlı bir oranda canlı hücre görüntüleme uygulanan toplam satın alma süresini azaltmak için gereklidir, böylece zaman içinde Z-halka &quot;dondurma&quot; ve hücre için fotohasar etkisini sınırlayan. [4] Not: Elde edilen kare sayısı bizim sistem için ve belirli hücre yapısına bağlıdır edildi, yoğunluk etiketleme aktivasyon oranı ve florofor tüm havuz yorucu olup olmadığını analiz için önemlidir. Canlı hücreler, bu ti olduğu kadar kısa bir süre içinde lokalizasyonları yeterli sayıda elde etmek için önemlidirBana en hücresel yapının hareketinin neden olduğu görüntünün bulanık olmaması için. 4. PALM Görüntü İnşaat <ol><li> Algılanan her nokta Centroid konumunu belirleyin. <ol><li> Matlab (MathWorks, Inc) içine görüntü yığınını yükleyin. </li><li> Tüm indirgeme boncuk dışlayan bir hücre etrafında bir bölgeye Görüntü yığını kırpın. </li><li> Arka seviyesinden, ama ortalama spot yoğunluğu altında nokta tespiti için bir yoğunluk eşik seçin. Biz 150 çerçeve penceresini kullanarak maksimum yoğunluk çalışan ortalaması hesaplanarak bir deney boyunca arka düzeyde varyasyon için hesap. Her çerçeve için yoğunluğu eşik sonra çalışan ortalama değerlerden enterpolasyonlanan. </li><li> Her bir çerçeve ilgili eşik çıkarın. Aday noktalar eşiğin üstünde şiddetleri ile üç bitişik pikseller olarak tanımlanır. </li><li> Iki boyutlu Gaussia her prospektif spot floresan yoğunluğu Fitn işlevi [Denklem # 1] doğrusal olmayan en küçük kareler algoritması (Şekil 2) kullanılarak. Her nokta lokalizasyonu hassas tespit fotonların toplam sayısı [Denklem # 2] kullanılarak hesaplanır. Bir yerelleştirme hassas Herhangi kötü kesim yerinde 20&#39;den fazla nm (sabit hücreler) ya da 45 nm (canlı hücreler) (Not # 5) atılır. Örtüşen yayıcılar nedeniyle muhtemelen ortalama yoğunluk, iki kat daha fazla bir yoğunluk ile her bir nokta da atılır. </li><li> Sabit hücreler için, kimin sentroid pozisyonu 45 nm içinde herhangi bir nokta göz ardı tarafından aynı molekülün tekrarlanan gözlemlere kaldır 6 veya daha az çerçeve tarafından öncesinde başka bir nokta. Canlı hücreler için tüm noktalar korunur. </li></ol></li><li> Indirgeme işaretleyici hareket kullanarak örnek sürüklenme kalibre. <ol><li> Bir indirgeme işareti etrafında bir 10x10 piksel bölgedeki kırpın. </li><li> Her bir çerçeve 4.1.3 olarak belirlenen ilgili eşik çıkarın. </li><li> Her yoğunluk profili Fiten küçük kareler uydurma algoritması ile çerçevesi iki boyutlu bir Gauss şekli varsayarak. </li><li> Çerçeve 1 göreli Centroid pozisyonları arasındaki deplasman hesaplayın. </li></ol></li><li> 4.2 hesaplanan uygun numune sürüklenme ile 4.1 belirlenen her benzersiz molekülün Centroid konumunu düzeltin. 3.7 ve 3.10 &#39;da elde edilen aydınlık görüntüleri karşılaştırın. Hücreler indirgeme işaretleri göre hareket gözlenirse, veri dışarı atılır. </li><li> 15x15 nm piksel oluşan tek bir görüntü üzerinde tüm düzeltilmiş Centroid pozisyonları Superimpose. Localisation hassas [Denklem # 2] eşit bir standart sapma ile Centroid konumda merkezli bir birim alanı, iki boyutlu Gauss profil olarak her benzersiz molekülün çizilir. Bir pikselin yoğunluğu o pikselin bir molekül bulma olasılığını (Şekil 3Aiv) ile orantılı bir olasılık yoğunluk haritası, bu sonuçlar. </li><li> Topluluğu görüntüleri PALM görüntülerini karşılaştırarak. <ol><li> Centro Replot4.4 gibi, ancak 150x150 nm piksel ve 250 nm eşit bir standart sapma ile bir düzlem üzerinde kimliği pozisyonları. Bu 3.8 (Şekil 3Aiii) edinilen kırınım-sınırlı, topluluk görüntü karşılaştırmak için kullanılabilecek bir kırınım-sınırlı bir görüntü, taklit eden bir PALM görüntü oluşturur. </li><li> Tespit molekülleri bütün halkın temsilcisi olduğunu onaylamak için, her iki görüntünün benzer şekil yapılarını göstermek olduğunu onaylamak için deneysel topluluk floresan görüntü (Şekil 3Aii, adım 3.8) ile yeniden topluluğu görüntü (Şekil 3Aiii, adım 4.5.1) karşılaştırmak , yönlendirme ve bağıl yoğunluğu. </li></ol></li></ol> [5] Not: minimum yerelleştirme hassas bir numunedeki tüm moleküller presizyonları çizilmesi ve uygun bir kesme belirleyerek, her bir görüntüleme yöntemi için deneysel olarak tespit edilmiştir. 5. PALM Görüntü Analizi <ol><li> Z-Ring widt Ölçmeh ve Çap. <ol><li> Böylece dikey olarak yönlendirmek hücrenin uzun ekseni (Şekil 4A) ile PALM görüntü döndürün. </li><li> Z-halkası içeren hücresel bölge kırpın. </li><li> Hücrenin uzun ekseni boyunca bir yoğunluk profili yansıtarak kümülatif yoğunluğu hesaplayın. </li><li> Bir Gauss dağılımı yoğunluk profili takın. Halka genişlik donatılmış Gauss dağılımı tam genişliğinde yarı maksimum (FWHM) (Şekil 4B) olarak tanımlanır. </li><li> Hücrenin kısa ekseni boyunca 5.1.2 kümülatif yoğunluk profili yansıtın. Halka çapı yoğunluk profili (Şekil 4C) olan tam uzunluğu olarak tanımlanır. </li></ol></li><li> (Not # 6) FtsZ Yoğunluk çiziliyor. <ol><li> (4.4) &#39;de anlatılanla sentroid pozisyonları Replot, ancak her bir eşsiz molekül 1 değeri verilmiştir ve sentroid pozisyonu karşılık gelen bir tek piksel tayin edecek şekilde Gauss profil olmadan. Her biri, bu şekilde, yoğunlukbu piksel piksel tespit moleküllerinin toplam sayısını temsil eder. Yoğunluk PALM görüntü de bir kontur arsa (Şekil 5E) olarak görüntülenebilir. </li></ol></li><li> Uzaysal Çözünürlük belirlenmesi. <ol><li> Teorik-başarılabilir uzaysal çözünürlüğü: algılanan tüm moleküllerinin ortalama tespit lokalizasyonu hassas kullanarak tüm numune için temsili bir PSF oluşturun ve FWHM (Denklem # 3) hesaplayabilirsiniz. </li><li> Deneysel-elde uzaysal çözünürlüğü: Aynı molekül tekrar gözlemler arasındaki ortalama deplasman hesaplamak. </li></ol></li></ol> [6] Not: hücre / cam arayüzü üzerinde ince bir tabaka (~ 200 nm) aktivasyon ve uyarma kısıtlamak için (TIR-PALM, Şekil 1 ve 5) toplam iç yansıma PALM kullanılır. böylece lamel en yakın olan membran ile ilişkili sadece FtsZ molekülleri tespit edilecektir.

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

PALM görüntüleri başka yollarla elde etmek zordur hedef protein moleküllerinin dağılımı ve düzenlenmesi detaylı analizi izin molekül sayısı ve hücre içindeki konumları hakkında bilgi içerir. Aşağıda PALM görüntülerin biyolojik alaka korurken doğru kantitatif bilgileri ayıklamak için alınması gereken önlemler özetlemektedir. Biz de en iyi canlı vs sabit hücreler kullanılarak elde edilebilir bilgileri inceleyebilirsiniz. Son olarak, biz hücre bölünmesi makine hakkında ek süper-çöz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 50 x MEM Amino Asitler </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitaminler 100 x </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td> Elektron Micrsocopy Bilimleri </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agaroz </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Altın Boncuk </td><td> Mikroküreler-nanokürecikler </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Görüntüleme Odası </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sahne Adaptör </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Ters Mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, 60x Amaç </td><td> Olimpos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Kamera </td><td> Andor Teknoloji </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Safir Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Safir Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Bakteriyel hücre bölünmesi midcell 1,2 de daha on temel proteinin koordineli montaj gerektirir. Bu sürecin temelinde bölünme planı 3,4 de FtsZ protein tarafından bir halka benzeri suprastructure (Z-ring) oluşumudur. Z-halka birden fazla tek sarmallı FtsZ protofilaments oluşur, ve Z-halka içinde protofilaments düzenlemesini anlama bir güç jeneratörü 5,6 olarak Z-halka montaj ve işlevi mekanizma fikir sunar. Bu bilgiler, geleneksel floresan ve elektron mikroskopi nedeniyle mevcut sınırlamalar zor kalmıştır. Geleneksel floresan mikroskobu ışığın kırınım sınırı (~ 200 nm) nedeniyle Z-halkasının bir yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayamaz. Elektron cryotomographic görüntüleme küçük C. FtsZ protofilaments dağınık algıladı crescentus 7 hücreleri, ancak bu gibi büyük hücreleri uygulamak zordurE. coli ya da B. subtilis. Burada bir süper-çözünürlük floresans mikroskopi yöntemi uygulama tanımlamak, fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM), kantitatif E. yapısal organizasyonu karakterize etmek coli Z-ring 8. PALM görüntüleme hem yüksek uzaysal çözünürlük (~ 35 nm) ve hedef proteinleri açık olarak tanımlaması sağlamak için özel etiketleme sunmaktadır. Biz 405 nm 9 aktivasyonu üzerine kırmızı floresan (eksitasyon = 561 nm) ve yeşil floresan (eksitasyon = 488 nm) geçer photoactivatable floresan proteini mEos2 ile FtsZ etiketli. Bir hurma deney esnasında, tek FtsZ-mEos2 moleküller stokastik olarak aktive edilir ve tek molekül karşılık gelen pozisyonlarda sentroid &lt;20 nm hassas bir şekilde tespit edilir. Z-halkasının bir süper çözünürlüklü görüntü sonra tüm tespit FtsZ-mEos2 moleküllerin Centroid pozisyonları atma tarafından yeniden yapılmıştır. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu yöntemi kullanarak, biz Z-ring ~ 100 nm sabit bir genişliğe sahip ve üç boyutta birbirleriyle örtüşen FtsZ protofilaments gevşek bir paket oluştuğunu buldu. Bu veriler, Z-halka 10, hücre devre bağımlı değişiklikleri daha ileri araştırmalar için bir sıçrama sağlamak ve ilgili diğer proteinler ile uygulanabilir.

Yukarıda tarif PALM görüntüleme yöntemi üretilen Z-halkanın iki-boyutlu, süper-çözünürlük oluşturmasıdır Şekil 3Aiv &#39;de gösterilmiştir. Aşağıda, onları elde edilebilir nitel ve nicel bilgiyi özetleyebilir. Nitelik, biz Z-ring konvansiyonel floresans görüntüleri (Şekil 3A-Dii ve iv karşılaştırın) olarak ayırt edilemeyen çoklu konfigürasyonlar (tek band veya sarmal yay) benimser düzensiz bir yapıda old...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Görüntüleme.  The Johns Hopkins University School of Medicine. Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Video: Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biyoloji

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.