Bu konfokal mikroskobik protokol, mikroalglerin ekolojik davranışlarının yorumlanmasına ve pigmentlerinin otofloresansını kullanarak laboratuvarda yavaş büyüyen aşırı ortamlardan adaptasyonlarına izin verecektir. Bu teknik invaziv değildir ve kimyasal bileşikler kullanılmadığı için eserleri en aza indirir. Ototrofların pigmentlerinin performansını ve buna karşılık gelen büyümeyi bilmek, turistik mağaralar ve mimari anıtlar için en büyük ilgi olan kontrol yöntemlerinin tasarlanmasına izin verecektir.
Chroothece mobilis inokulumunu, agar kültüründen deniz suyu ortamına veya SWES sıvı ortamına aktararak hazırlamaya başlayın. Tüm kültürleri, düşük beyaz ışık yoğunluğu altında 20 santigrat derecede 16 ila 8 açık karanlık fotoğraf periyodu ile iki hafta boyunca ve istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar titremeden koruyun. Farklı deneyler için 24 kuyucuklu bir plakada aşılamak için mililitre hücre yoğunluğu başına beş kez 10 ila üçüncü hücrelere sahip üstel faz kültürünün bir mililitresini kullanın.
Tek renkli ışık efektini yeniden üretmek için, yeşil ışığın 506 nanometre dalga boyunda bir tepe noktası ile 470 ila 570 nanometreden geçmesine ve 590 ila 720 nanometre arasında bir filtre kullanılarak ayarlanan kırmızı ışığa ve 678 nanometrede zirvelere geçmesine izin veren yeşil filtreyi kullanın. Hücre kültürlerini iki hafta boyunca bu ışığa maruz bırakın. Lazer de dahil olmak üzere ters çevrilmiş konfokal lazer tarama mikroskobunun tüm bileşenlerini açın.
SWES büyüme ortamındaki hücreleri, 24 kuyucuklu plakanın her bir deneysel kuyucuğundan, görüntüleme için 35 milimetrelik bir cam alt kaba monte edin. 63X veya 1.30 sayısal diyafram açıklığını veya NA gliserol daldırma hedefini seçin ve gliserolü lensin üzerine yerleştirin. Daha sonra, kuyu plakasını mikroskop aşamasına yerleştirin ve numunenin görüntü yakalama sırasında hareket etmemesini sağlayın.
Numuneyi ışık yolunda ortalayın ve en yüksek floresan yoğunluğuna sahip düzlemi seçerek hücrenin merkezine odaklanın. İşiniz bittiğinde, görüntü alma yazılımını açın ve edinme modundaki açılır listeden XY lambda'yı seçin. Lazerin uyarma çizgisini seçin 561 nanometre, sekiz bit dinamik aralık ve 1024 x 1024 piksel.
10 nanometre bant genişliğindeki floresan emisyon spektrumlarını ve 570 ila 760 nanometre aralığında dört nanometrelik lambda adım boyutunu toplayın. İğne deliğini tek bir hava ünitesine yerleştirin ve lambda tarama alımını çalıştırın. Bu işlemi farklı görüş alanlarında ve farklı kırmızı ve yeşil ışık koşullarında tekrarladıktan sonra, tüm verileri kaydedin.
Lambda taraması alındıktan sonra, toplanan floresan emisyon spektrumlarını değerlendirmek için yazılımın üst kısmındaki nicelleştir penceresine tıklayın. Açık proje penceresine gidin ve bir XY lambda dosyası seçin. Görüntüleme yazılımında yığılmış profil analizini seçin ve ortalama floresan yoğunluğunu analiz etmek için bir hücrenin merkezinde dört mikrometre karelik bir ilgi alanı tanımlayın.
İşlemi farklı koşullar altında farklı hücrelerle tekrarlamadan önce verileri ve CSV'yi dışa aktarın. Ardından, CSV dosyasında sırasıyla phycoerythrin phycocyanobilin, C.phycocyanin, allophycocyanin ve chlorophyll A'nın maksimum floresan verilerini seçerek ölçülen tüm ilgili bölgelerin farklı floresan emisyon zirvelerini seçmek için CSV dosyalarını açın. İşiniz bittiğinde, her bir fikobiliprotein ve klorofil zirvesinden elde edilen tüm maksimum floresan değerlerini içeren yeni bir tablo oluşturun ve verileri bir grafiğe çizin.
Ortalama floresan yoğunluğunda anlamlı farklılıklar gözlendi. Fikoeritrin fikosiyanobilinin ortalama floresan yoğunluğu, hücreler tek renkli yeşil ışığa maruz kaldığında önemli ölçüde azalmıştır. Buna karşılık, kırmızı ışıkta kontrole kıyasla hiçbir fark gözlenmedi.
Yeşil ışık, allofikosiyanin ve klorofil A üzerinde ters etkiye sahipti; burada ortalama floresan yoğunluğu, artan miktar veya anten komplekslerinin diğerleri arasında gelişmiş bağlantısı nedeniyle anten komplekslerinin adaptasyonu nedeniyle önemli ölçüde artmıştır. Kırmızı ışık, allofikosiyanin ve klorofil floresansında önemli olmayan bir artış sağladı. Farklı büyüme koşullarının kültürdeki hücreler üzerindeki etkisini incelemek için, ölçümleri tam olarak aynı mikroskop ayarlarıyla yapmak çok önemlidir.
Otofloresan organizmaların kültürüyle ilgili diğer çevresel parametreleri ve görünür spektrumdaki floresan sinyalini analiz etmek mümkündür. Bu teknik, birkaç otofloresan pigmente sahip yaşam organizmalarını incelemek için çok güçlü bir yaklaşımdır.
