Bu protokol, sulu ve kurutulmuş formlarda hücre dışı veziküllerin AFM görüntülemesi, elektrostatik immobilizasyonu, yüzey taraması, vesitik tanımlama ve veri analizi ve yorumlanması için basit bir hazırlık özetlensin. Bu tekniğin en büyük avantajı, veziküllerin cilt yüzeyinde uygun elektrostatik fiksasyonu ve immobilizasyonun neden olduğu şekil bozulmasını hesaba katmak için post görüntüleme analizidir. Elde edilen vezikül boyutlandırma sonuçları, pahalı ve zorlu bir teknik olmaya devam eden Altın Standart KriyoTEM Görüntüleme ile uyumlu.
Yeni bir AFM kullanıcısıysanız, sulu numunelere geçmeden önce kuru numunelerin karakterizasyonuyla başlayın. Çünkü sulu numune alımLarını etkileyebilen çok sayıda ek faktör vardır. Başlamak için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi ekstrasellüler vezikülleri bir biyo-sıvıdan ayırın.
Daha sonra, manyetik paslanmaz çelik numune diskine mika diski sıkıca takın. Yeni bir malzeme tabakasını ortaya çıkarmak için keskin bir jilet kullanarak mika diski ayırın. Oda sıcaklığında, on milimolar nikel II klorür çözeltisi yüz mikro litre ile on saniye mika üst yüzeyi tedavi.
Bu, yüzeyin yükünü negatiften pozitife değiştirir. Nikel II klorür çözeltisini tüy bırakmayan silme veya lekeleme kağıdı ile lekele. Daha sonra mika yüzeyini üç kez deiyonize suyla yıkayın ve kuru bir azot akışı ile kurulayın.
AFM numune diskini bağlı yüzeymodifiye mika ile bir petri kabına yerleştirin. Daha sonra, çözeltimililitre başına dört ve kırk milyar parçacık arasında bir konsantrasyon elde etmek için PBS ile ekzozomları seyreltin. Nano parçacık izleme analizini kullanarak seyreltilmiş parçacık konsantrasyonu doğrulayın.
Bir pipetten seyreltilmiş ekzozom çözeltisinin yüz mikrolitresini boşaltarak mika yüzeyinde sessile bir damla oluşturun. Daha sonra petri kabının kapağını yerleştirin ve numune buharlaşmasını azaltmak için parafen filmile kapatın. Buzdolabında 12 saat kuluçkaya yat.
Kuluçkadan sonra, yüzeyi bozmadan numunenin yüzde 80-90'ını dikkatlice aspire edin. Bu noktada, ekzozomlar mika substrat üzerinde elektrostatik olarak hareketsiz hale gelecektir. Sulu numuneleri görüntülerken yüzeyi PBS ile üç kez durulayın.
Durulama işlemi boyunca numunenin sulu tutulmasına özen tin. Mika yüzeyini PBS ile yıkadıktan sonra, numuneyi kapsayacak şekilde sıvı ve pipet kırk mikrolitre taze PBS'nin yüzde 80 ila 90'ını çıkarın. Sulu numune görüntüleme için hazır.
Kurutulmuş EV'leri görüntülerken, substratı üç kez deiyonize suyla durulayarak tuzları yüzeyden çıkarın. Mümkün olduğunca çok sıvı aspire ettikten sonra, yüzeye dokunmadan, kuru azot akışı ile geri kalanı kuru. Kurutulmuş hücre dışı vezikülleri görüntülemek için, dokunarak ve temassız görüntüleme modlarında havada tarama için tasarlanmış bir kantili seçin ve sonda tutucuya monte edin.
Örneği AFM aşamasına yerleştirin. Manyetik paslanmaz çelik numune diski sahnede numuneyi hareketsiz hale getirecektir. Sonda tutucuyu AFM'ye yerleştirin.
Hazırlık ve sahne termal olarak dengelemek için zaman bekleyin. 512 satırda 5x5 mikron olan bir alanı bir hertz'in tetkik hızında tmak için dokunma modunu kullanın. Topografya ve numunenin yüzey özellikleri hakkında ücretsiz bilgi sağlarken hem yükseklik hem de faz görüntülerini elde edin.
Görüntülenmiş bir alan ve görüntüyü oluşturmak için seçilen satır sayısı yla tazyik süresi artar, ancak tazyik hızıyla azalır. Hızlı tetkik hızları görüntü kalitesini etkileyebilecek olduğundan, hız kazanılması süresi ile görüntü kalitesi arasında bir denge olmalıdır. Sulu vezikülleri görüntülemek için yumuşak, sulu numuneleri taramak için uygun bir kantil i seçin ve kantili sıvılarda tarama için tasarlanmış bir sonda tutucuya monte edin.
Tarama sırasında sıvıya hava kabarcıkları sokulma olasılığını azaltmak için kantilin ucunu PBS ile ısla. Ardından, örneği AFM aşamasına geçirin. Numune termal olarak dengelendikten sonra, sulu mika yüzeyini dokunma modunda görüntüleyin.
Hem yükseklik hem de faz görüntülerini edinin. Alınan görüntüleri analiz etmek için önce Veri İşlemi'nin seçtiği SPM modlarına gidin, ardından Tip'i seçin ve Örneklem'i tatmak için kullanılan geometriyi ve ucun boyutlarını seçin ve yüzey rekonstrüksiyonunu gerçekleştirerek Tamam'Düzelt'i tıklatın. Görüntüyü açın.
Menüden Veri İşlemi'ni seçin, Daha sonra SPM Modes'u seçin', ardından Yüzey Rekonstrüksiyonunu seçin ve Ok'Next'i seçin, Veri İşlemi'ni seçin, ardından Düzey'i seçin ve görüntüleme düzlemini hizalamak ve yüzeydeki eğimi tetkikten kaldırarak laboratuvar XY düzlemini eşleştirmek için Düzlem Seviyesi'ni seçin. Veri İşlemi'ni doğru veriler'i seçerek görüntüdeki satırları hizala ve ardından Hizalama Satırları'nın her bir tarama satırının ortalama yüksekliğini bulan ve verilerden çıkaran bir algoritma olan medyan dahil olmak üzere çeşitli hizalama seçenekleri kullanılabilir. Daha sonra, Veri İşlemi'nin ardından Doğru Veri'ye gidin ve Scars'Bu olarak bilinen yaygın tarama hatalarını ortadan kaldır', mika yüzeyini sıfır yükseklikte hizalamak, Veri İşlemi'nin menüsüne gidin ve Level'drop menüsünden Flatten Base'in'ini seçin.
Grains'in menüsüne giderek taranmış yüzeydeki ekstra hücresel vezikülleri tanımlayın ve Threshold'Bu algoritma, yüzeyimsiz ekzozomları, kullanıcı seçilen eşiğin üzerindeki yüksekliğe göre sıfır yüzey yüzeyinden çıkan parçacıklar olarak tanımlar. Bir ve üç nanometre arasındaki aralıkta bir eşik seçin. Bu arka zemin girişim çoğu ortadan kaldıracaktır.
Son olarak, Tanecikler menüsünden erişilebilen kullanılabilir dağılım algoritmalarını kullanarak tanımlanan veziküllerin geometrik ve boyutsal karakterizasyonunu gerçekleştirin. Diğer hesaplama araçları ve özel bilgisayar programları tarafından özel analiz için Gwyddion'dan AFM verilerini dışa aktarın. Nikel klorür yüzey modifikasyonu zamana bağlı ekstra hücresel veziküllerin immobilizasyonu ile sonuçlanır.
Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonu 24 saatlik kuluçkadan sonra aşırı yoğundur, 12 saatlik kuluçka ise daha az ekzozom ve doğru analiz edilmesi daha kolay olan verileri taranan verilere yol açar. Bu AFM görüntüsü, modifiye mika yüzeyinde elektrostatik olarak hareketsiz hale getirilen sulu MCF7 ekzozomlarını göstermektedir. İlgili AFM faz görüntüsü, yükseklik görüntüsündeki tanelerin membran vezikülleri için beklendiği gibi yumuşak nano parçacıklar olduğunu doğrular.
Aynı çizgi boyunca üç veziküliçin yükseklik verileri burada gösterilmiştir. Bu profiller, modifiye mikanın pozitif yük yüzeyine ekzozomların elektrostatik çekiminin neden olduğu düzleştirilmiş bir şekli göstermektedir. Şekil bozulması immobilize vezikül ve kesitinin geniş bir görünümünde belirgindir.
Çözeltideki ekzozomların küresel boyutunu tahmin etmek için, yüzey immobilize ve küresel membran zarfları ile çevrili hacimleri eşleşebilir. Çözeltideki globüler veziküllerin boyut dağılımı 561 immobilize veziküllerin AFM verilerinden belirlendi. CryoTEM görüntülerindeki vezikül boyutları AFM sonuçlarıyla uyumlu.
Hyrrated ekzozomları görüntülemeden önce yüzeyi PBS ile iyice durulamayı unutmamak önemlidir. Bu, gelen ekzozomları ortadan kaldırır ve AFM ucuna bağlanmalarını önler. Kurutulmuş ekzozomları görüntülerken, substratı yükselmek için DI suyu kullandığınızdan emin olun.
DI yıkama substrat kurur gibi yüzeyde tuz kristallerinin oluşumunu önleyecektir. Varsa, tuz kristalleri görüntü işleme zor bir görev yapacaktır.
