Bu yöntem, bir yaralanma veya hastalık tan sonra binlerce tek hücrede gen ekspresyonu değişikliklerini anlamak gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, karmaşık bir doku içindeki tek tek hücrelerin transkripsiyonlarını incelememize ve belirli bir popülasyondaki işlevsel dinamikleri daha iyi takdir etmemize olanak sağlamasıdır. Protokolümüzün avantajı, birincil dokularda tek hücrelerin izolasyonundan bu veri setinin analizine ve görselleştirilmesine kadar kapsamlı yöntemler sunmasıdır.
Bu yöntem deri ve sinirden tek hücreli süspansiyonlar başlasa da, tanımladığımız sıralama yöntemleri herhangi bir memeli dokusunu incelemek için uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren Elodie Labit ve Wisoo Shin, benim laboratuvar iki stajyer olacaktır. Başlamak için, önce farenin arka bölgesinden deri keserek bir ötenazi farenin siyatik sinir inceleyin.
Uyluk uzunluğu boyunca bir kesi yapmak için steril bir neşter bıçak kullanın. Sonra ortaya çıkarmak ve siyatik sinir kaldırmak için ince çerkes ve makas kullanın. Dorsal arka deri incelemek için, omuz omuz, kıç boyunca ve arka aşağı kesiler yapmak için ince çerkeçler ve makas kullanın.
Dokuları buz gibi HBSS ile iki kez yıkayın. Bir diseksiyon mikroskop altında, istenmeyen bağ dokusu, yağ mevduat veya enkaz kaldırın. Sadece cilt için, steril bir neşter bıçak kullanarak, ince dilimler halinde deri kesti.
Cilt dermiselde etmek için, 37 santigrat derece 30 ila 40 dakika, 10 santimetrelik bir çanak HBSS, dispase deri dilimleri float. Dermis soyma ve ayırmak için ince forceps kullanın ve sonra epidermis atın. Sonra, cilt ve sinir için, bir ila iki milimetre adet halinde her örnek kıyma steril neşter bıçakları bir çift kullanın.
15 mililitrelik konik tüp içinde mililitre soğuk kollajenaz-dört enzim başına iki gram, taze çözülmüş içine doku parçaları yerleştirin. Enzimdeki her numuneyi 37 derecelik santigrat banyosunda her 10 dakikada bir hafifçe sallayarak 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 dakika, doku 20 ila 30 kez triturate ve su banyosu dönmek için bir P1000 pipetter kullanın.
Çözelti bulutlu görünene kadar her 30 dakikada bir triturasyon tekrarlayın ve doku parçaları büyük ölçüde ayrıştırılır. Sadece cilt için, kuluçka son saat içinde, cilt örneğine mililitre DNAAse başına bir miligram ekleyin. Bazı hücre tipleri mekanik strese diğerlerinden daha duyarlı olduğundan, aşırı dissosyasyon teknikleri popülasyonunuzu saptırabilir.
Genel dissosilasyon yüksek hücre verimleri elde etmek için önemlidir, ve doku kompozisyonu doğru bir temsil. Bundan sonra, her doku örneğini iki kez filtrelemek için 50 mililitrelik konik tüpün üstüne 40 mikrometrelik bir filtre kullanın. Filtreyi yüzde bir BSA/HBSS ile durula.
El yazmasında açıklandığı gibi örnekleri santrifüj ettikten sonra, HBSS'de yüzde bir BSA içeren hücre peletini geniş delikli bir uç kullanarak yeniden askıya alın ve buzun üzerine yerleştirin. Canlılık boyası eklenmesi, hazırlığınızı optimize etmenize yardımcı olacaktır. En az yüzde 80 canlı hücreleri hedeflemeniz gerekir.
Optimize edildikten sonra, bu ve diğer kalite kontrol adımları, RNA kalitesini daha iyi koruyacak ve hücre kaybını azaltacak ayrışma sürecini hızlandırmak için atlanabilir. FACS kullanarak canlı ve sağlıklı hücreleri izole etmek için, ilk örnek koleksiyonları için buz gibi yüzde bir BSA / HBSS sekiz mililitre ile 15 mililitre dar alt tüpler hazırlamak. Sıvının yüzeyi ile tüpün içi arasındaki arabirimin nemli olmasını sağlamak ve statik ve yüzey gerilimini önlemek için, tüpleri toplamadan önce ters çevirin.
FACS hücre sıralamasından hemen sonra, hücreler 15 mililitrelik bir tüpte toplandıktan sonra, tüm hücreleri tüpün yan yüzeyinden yıkamak ve itmek için yüzde bir BSA/HBSS'nin mililitresini kullanın. Sonra sekiz dakika boyunca 260 g her örnek santrifüj. Supernatant attıktan sonra, bir yüzde BSA / HBSS hücre pelet yeniden askıya almak ve bir tüp 33.8 mikrolitre ekleyin ve buz üzerinde tüp tutun.
Bu adım, standart bir kitten elde edilen reaktifler kullanılarak yapılacak şekilde tasarlanmıştır. Gösterilen tüm adımlar üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmelidir. GEM üretimine hazırlanmak için, üreticinin protokolüne göre, çip tutucuya bir çip yerleştirin, buz üzerine bir hücre ana karışımı hazırlayın.
33,8 mikrolitre kendinden süspansiyon içeren bir tüpe ana karışımın 56,2 mikrolitresini ekleyin. Çip hazırlamak için, ilk olarak yüzde 50 gliserol kullanılmaz kuyulara. Sonra hücre ana karışımı 90 mikrolitre iyi bir, jel boncuk 40 mikrolitre iyi iki ve 270 mikrolitre de üç bölümleme yağı ekleyin.
Çipi bir contayla kaplayın. Fişi yüklemek ve tek hücreli bir denetleyicide çalıştırmak için önce tepsiyi çıkarın. Çipi tepsiye yerleştirin.
Tepsiyi geri çekve oynat tuşuna basın. Tam çalışmadan sonra, numunenin 100 mikrolitresini toplayın ve bir PCR tüpüne yerleştirin. PCR tüplerini önceden ayarlanmış bir PCR makinesine yerleştirin ve kine göre çalıştırın.
Çalıştırmanın ardından, GEM'ler poliadenlated mRNA tam uzunlukta, barkodlu cDNA, içerecektir. Tüpleri bir gecede eksi 20 dereceye yerleştirin. Kitaplık oluşturma, sıralama, hizalama ve çözümleme ile devam edin.
Örnekler el yazmasında açıklandığı şekilde sıralanıp hizalandıktan sonra, verileri NCBI'nin GEO'su gibi genel bir depoya yatırın. Bunu yapmak için gönderen hesabına kaydolun. İlk olarak, meta veri sayfasını indirerek GEO gönderimini tamamlayın.
Proje gönderimi başına yalnızca bir meta veri sayfası eklediğinden emin olun. Elektronik tabloyu dizine yerleştirin. İkinci olarak, tüm kitaplıklar için hücre korucusu sayısı komut dosyasından oluşturulan ham veri dosyasını dizine ekleyin.
Üçüncü klasör işlenir veri dosyaları. Tüm kitaplıklar için hücre korucusu sayısı komut dosyasından oluşturulan işlenmiş veri dosyalarını dizine yerleştirin. Üç bileşeni de içeren dizini aktarmak için GEO gönderenin FTP sunucu kimlik bilgilerini kullanın.
Cell Ranger çalıştırdıktan sonra, analize hazır gen barkod matrisler daha gelişmiş biyoinformatik kullanılarak işlenebilir. İlk olarak, gen sayısını, benzersiz moleküler tanımlayıcıların sayısını ve hücre doublet'lerini ve aykırılarını tanımlamak için mitokondriyal genlerin yüzdesini görselleştirmek için keman ve dağılım çizimleri oluşturan Seurat R paketi kullanılarak ön işlem miktar kontrolleri yapıldı. Temel bileşenlerin veya bilgisayarların seçiminde, PC ekseninin standart sapma platosunun ötesindeki bilgisayarların dışlandığı dirsek çizimleri kullanılmıştır.
Kümeleme çözünürlüğü de manipüle edildi. Düşük çözünürlük, her kümenin tanımlı bir hücre türünü temsil etmesi yle daha az hücre kümesine yol açtı. Yüksek çözünürlük, hücre popülasyonunun alt türlerini veya geçiş durumlarını temsil eden daha yüksek hücre olasılığına yol açtı.
Düşük çözünürlüklü küme ayarları, belirli bir kümedeki en yüksek ifade edilen genleri tanımlamak için ifade ısı haritalarının daha fazla analizi için kullanılmıştır. Bireysel aday genler, Seurat'ın özellik çizim iþlemi kullanarak tSNE parsellerinde görselleştirildi, bu da deşifre edilmesine olanak sağlayan, örneğin makrofajlari temsil eden kümeler olup olmadigini. Her ikisi de küme iki ve dört CD68, bir pan-makrofaj belirteç ifade.
Diğer paketler de kalite kontrol için araçlar sağlar, örneğin, Monocle, hücre yörüngeleri oluşturmak için kullanılan bir R paketi, düşük kaliteli hücreleri kaldırır ve tüm hücreler arasında mRNA dağılımı günlük normal olmasını sağlar ve üst ve alt sınırlar arasında düştü. Daha sonra bilinen soy belirteç genleri kullanılarak tek hücreler sınıflandırıldı ve sayıldı ve ilgi çekici işaretleri ifade eden hücreler bir numaralı hücre tipine atandı. Bir numaralı hücre tipinin fibroblast olduğu belirlendi.
Bu popülasyon fibroblastlar gelişim yörüngesi oluşturmak için değerlendirildi. Bu prosedürü takiben, kantitatif PCR gibi diğer yöntemler, yerinde hibridizasyon, bir immünist kimya gen ekspresyonu sonuçlarının doğruluğunu doğrulamak için yapılmalıdır. Tek hücreli mRNA dizilimi artık birçok farklı alanda araştırmacıların hücreden hücreye heterojenliği keşfetmelerine ve homeostaz sırasında farklı dokulardaki fonksiyonel dinamikleri belirlemelerine ve bunların yaralanmadan veya hastalık gelişiminde nasıl değişebileceğini belirlemelerine yol açmıştır.
