Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como la comprensión de los cambios en la expresión génica en miles de células individuales después de una lesión o una enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite diseccionar transcriptomas de células individuales dentro de un tejido complejo, y apreciar mejor la dinámica funcional dentro de una población determinada. La ventaja de nuestro protocolo es que proporciona métodos integrales, desde el aislamiento de células individuales en los tejidos primarios, hasta el análisis y visualización de este conjunto de datos.
Aunque este método comienza a partir de suspensiones unicelulares de la piel y el nervio, los métodos de secuenciación que describimos se pueden aplicar para estudiar cualquier tejido de mamíferos. Demostrando este procedimiento serán Elodie Labit, y Wisoo Shin, dos aprendices de mi laboratorio. Para empezar, disecciona el nervio ciático de un ratón eutanasiado cortando primero la piel lejos de la región posterior de la parte posterior del ratón.
Use una cuchilla de bisturí estéril para hacer una incisión a lo largo de la longitud del muslo. Luego usa fórceps finos y tijeras para exponer y quitar el nervio ciático. Para diseccionar la piel dorsal de la espalda, utilice fórceps finos y tijeras para hacer incisiones de hombro a hombro, a través de la grupa y por la espalda.
Lave los tejidos dos veces con HBSS helado. Bajo un microscopio diseccionable, elimine el tejido conectivo no deseado, los depósitos de grasa o los desechos. Sólo para la piel, cortar la piel en rodajas finas, utilizando una hoja de bisturí estéril.
Para obtener la dermis de la piel, flote la piel en rodajas dispase, en HBSS en un plato de 10 centímetros, durante 30 a 40 minutos a 37 grados centígrados. Utilice fórceps finos para pelar y separar la epidermis de la dermis, y luego deseche la epidermis. Luego, para la piel y los nervios, usa un par de cuchillas de bisturí esterilizado para picar cada muestra en trozos de uno a dos milímetros.
Coloque los trozos de tejido en una enzima recién descongelada, dos gramos por mililitro de colagenasa fría y cuatro en un tubo cónico de 15 mililitros. Incubar cada muestra en la enzima en un baño celsius de 37 grados durante 30 minutos con un suave temblor cada 10 minutos. A los 30 minutos, utilice un pipetter P1000 para triturar el tejido de 20 a 30 veces, y volver al baño de agua.
Repita la trituración cada 30 minutos hasta que la solución parezca turbia y los trozos de tejido se disocucicen en gran medida. Para la piel solamente, en la última hora de incubación, añadir un miligramo por mililitro DNAse a la muestra de piel. Dado que algunos tipos de células son más sensibles que otros al estrés mecánico, las técnicas de disociación excesiva pueden sesgar a su población.
La disociación general es fundamental para lograr altos rendimientos celulares y una representación precisa de la composición del tejido. Después de eso, utilice un filtro de 40 micrómetros en la parte superior del tubo cónico de 50 mililitros para filtrar cada muestra de tejido dos veces. Enjuague el filtro con un uno por ciento de BSA/HBSS.
Después de centrifugar las muestras como se describe en el manuscrito, vuelva a suspender el pellet celular en HBSS, que contiene un uno por ciento de BSA, utilizando una punta de diámetro ancho, y colocar en hielo. La adición de tinte de viabilidad le ayudará a optimizar su preparación. Usted debe apuntar a por lo menos 80 por ciento células viables.
Una vez optimizado, este y otros pasos de control de calidad se pueden omitir con el fin de acelerar el proceso de disociación, que preservará mejor la calidad del ARN y reducirá la pérdida de células. Para aislar las células viables y sanas utilizando FACS, primero prepare tubos de fondo estrecho de 15 mililitros con ocho mililitros de BSA/HBSS al frío helado al uno por ciento para las colecciones de muestras. Para asegurarse de que la interfaz entre la superficie del líquido y el interior del tubo está húmeda, y para evitar la tensión estática y superficial, invierta los tubos antes de las colecciones.
Inmediatamente después de la clasificación celular FACS, una vez que las células se recogen en un tubo de 15 mililitros, utilice un mililitro de un porcentaje de BSA/HBSS para lavar y empujar todas las células hacia abajo desde la superficie lateral del tubo. A continuación, centrifugar cada muestra a 260 g durante ocho minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un porcentaje de BSA/HBSS, y agregue 33,8 microlitros a un tubo, y mantenga ese tubo en hielo.
Este paso está diseñado para realizarse utilizando reactivos obtenidos de un kit estandarizado. Todos los pasos demostrados deben realizarse siguiendo las instrucciones del fabricante. Para prepararse para la generación de GEM, coloque un chip en el soporte de la viruta, prepare una mezcla maestra de celda sobre hielo, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Añadir 56,2 microlitros de la mezcla maestra a un tubo que contenga 33,8 microlitros de auto suspensión. Para preparar el chip, primero al 50 por ciento de glicerol a los pozos que no se utilizarán. A continuación, agregue 90 microlitros de la mezcla maestra de la célula a uno bien, 40 microlitros de cuentas de gel a dos bien, y 270 microlitros de aceite de partición a pozo tres.
Cubra el chip con una junta. Para cargar el chip y ejecutarlo en un controlador de una sola celda, primero expulse la bandeja. Coloque el chip en la bandeja.
Retirar la bandeja y pulsar play. Después de la ejecución completa, recoja 100 microlitros de la muestra y colóquelos en un tubo pcR. Coloque los tubos PCR en una máquina PCR preestablecida y ejecútese de acuerdo con el kit.
Después de la ejecución, los GEM incluirán cDNA con código de barras de longitud completa, de ARNm poliadenilado. Coloque los tubos a menos 20 grados centígrados durante la noche. Continúe con la construcción, secuenciación, alineación y análisis de la biblioteca.
Una vez que las muestras se secuencian y alinean como se describe en el manuscrito, deposite los datos en un repositorio público, como GEO de NCBI. Para ello, regístrese en la cuenta del remitente. En primer lugar, complete el envío GEO descargando la hoja de metadatos.
Asegúrese de incluir solo una hoja de metadatos por envío de proyecto. Coloque la hoja de cálculo en el directorio. En segundo lugar, agregue el archivo de datos sin procesar generado a partir del script de recuento de rangos de celdas para todas las bibliotecas en el directorio.
La tercera carpeta se procesan archivos de datos. Coloque los archivos de datos procesados generados a partir del script de recuento de ranger de celdas para todas las bibliotecas en el directorio. Utilice las credenciales del servidor FTP del remitente GEO para transferir el directorio que contiene los tres componentes.
Después de ejecutar Cell Ranger, las matrices de códigos de barras genéticos listos para el análisis se pueden procesar más allá utilizando bioinformática avanzada. En primer lugar, se realizaron comprobaciones de cantidad de preprocesamiento utilizando el paquete Seurat R, que generó violín y parcelas de dispersión para visualizar el número de genes, el número de identificadores moleculares únicos y el porcentaje de genes mitocondriales para identificar dobletes celulares y valores atípicos. Para la selección de componentes principales, o PC, se utilizaron gráficas de codo, en las que se excluyeron los PC más allá de la meseta de la desviación estándar del eje de PC.
La resolución de la agrupación en clústeres también fue manipulada. La baja resolución dio lugar a menos clústeres de celdas, y cada clúster probablemente representaba un tipo de celda definido. La alta resolución dio lugar a una mayor probabilidad celular, que representaba subestilos, o estados de transición, de una población celular.
La configuración del clúster de baja resolución se utilizó para un análisis posterior de los mapas de calor de expresión para identificar los genes más expresados en un clúster determinado. Los genes candidatos individuales se visualizaron en las gráficas tSNE, utilizando la función de trazado de características de Seurat, que permitían descifrar, si había racimos que representaban, por ejemplo, macrófagos. El clúster dos y cuatro expresaron CD68, un marcador pan-macrophage.
Otros paquetes también proporcionan herramientas para el control de calidad, por ejemplo, Monocle, un paquete R utilizado para construir trayectorias de celdas, elimina celdas de mala calidad y garantiza que la distribución del ARNm entre todas las celdas sea normal y esté comprendida entre los límites superior e inferior. Las células individuales fueron clasificadas y contadas, utilizando genes marcadores de linaje conocidos, y las células que expresaban marcadores de interés se asignaban al tipo de celda número uno. Se determinó que el tipo de célula número uno eran fibroblastos.
Esta población fue evaluada para construir la trayectoria de desarrollo de los fibroblastos. Después de este procedimiento, se deben realizar otros métodos como la PCR cuantitativa, la hibridación in situ, una química inmunizante para validar la exactitud de los resultados de la expresión génica. La secuenciación de ARNm de una sola célula ha allanado el camino para que los investigadores en muchos campos diferentes exploren la heterogeneidad de célula a célula, e identifiquen la dinámica funcional dentro de diferentes tejidos durante la homeostasis, y cómo estos pueden cambiar después de la lesión o en el desarrollo de la enfermedad.
