この方法は、怪我や病気の後に何千もの単一細胞にわたる遺伝子発現の変化を理解するなど、微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複雑な組織内の個々の細胞のトランスクリプトームを解剖し、特定の集団内の機能的ダイナミクスをよりよく理解できることです。私たちのプロトコルの利点は、一次組織の単一細胞の分離から、このデータセットの分析と視覚化に至る包括的な方法を提供することです。
この方法は皮膚および神経からの単細胞懸濁液から始まるが、我々が記述するシーケンシング方法は、哺乳類組織を研究するために適用することができる。この手順を実証するのは、エロディ・ラヴィットと、私の研究室の2人の研修生であるWisoo Shinです。まず、マウスの後ろの後ろの領域から皮膚を切り離すことによって安楽死させたマウスの坐骨神経を解剖する。
無菌メスの刃を使用して、太ももの長さに沿って切開を行います。その後、坐骨神経を露出し、除去するために細かい鉗子とはさみを使用してください。背側の背中の皮膚を解剖するには、細かい鉗子とはさみを使用して、肩から肩、ランプを横切り、背中を下に切開します。
氷冷HBSSで2回組織を洗浄します。解剖顕微鏡の下で、不要な結合組織、脂肪沈着物、または破片を除去する。皮膚のみの場合は、滅菌メスの刃を使用して薄いスライスに皮膚をカットします。
皮膚真皮を得るために、皮膚スライスをディスパーゼで、HBSSで10センチメートル皿に、摂氏37度で30〜40分間浮かべる。細かい鉗子を使用して表皮を真皮から剥離し、分離し、表皮を捨てます。その後、皮膚と神経のために、滅菌メスの刃のペアを使用して、各サンプルを1〜2ミリメートルにミンチします。
ティッシュピースを解凍したばかりの部分に入れ、15ミリリットルの円錐形チューブに1ミリリットルの冷たいコラゲザーゼ4酵素あたり2グラム置きます。各サンプルを37°Cの浴槽に30分インキュベートし、10分ごとに穏やかな揺れをします。30分で、P1000ピペッタを使用して組織を20〜30回トリチュレートし、水浴に戻します。
溶液が濁って見えるまで30分ごとにトリチャレーションを繰り返し、組織の塊は大部分解化されます。皮膚のみの場合、インキュベーションの最後の1時間に、皮膚サンプルにミリリットル1ミリグラムのドナーゼを加えます。一部の細胞タイプは機械的ストレスに対して他の細胞よりも敏感であるため、過度の解離技術は人口に偏る可能性があります。
一般的な解離は、高い細胞収率を達成するために重要であり、組織組成物の正確な表現です。その後、50ミリリットル円錐形チューブの上に40マイクロメートルのフィルターを使用して、各組織サンプルを2回濾過します。1 パーセント BSA/HBSS でフィルターをリンスします。
原稿に記載されているようにサンプルを遠心した後、広孔先端を使用して1%BSAを含むHBSS内の細胞ペレットを再中断し、氷の上に置く。生存性染料の添加は、あなたの準備を最適化するのに役立ちます。少なくとも80%の生存細胞を目指すべきです。
最適化が完了すると、解離プロセスを早めるためにこの品質管理手順を省略して、RNAの品質を維持し、細胞損失を低減させることができます。FACSを使用して生存可能で健康な細胞を分離するには、まずサンプルコレクション用に8ミリリットルの氷冷1%BSA/HBSSで15ミリリットルの狭底チューブを調製します。液体の表面とチューブの内側の間の界面が湿っていることを確認し、静的および表面張力を防ぐために、収集前にチューブを反転させます。
FACS細胞の選別直後に、細胞を15ミリリットルのチューブに集めたら、1%のBSA/HBSSを1ミリリットル使用して、チューブの側面からすべての細胞を洗い流し、押し下げる。その後、各サンプルを260gで8分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを1%BSA/HBSSに再び懸濁し、チューブに33.8マイクロリットルを加え、そのチューブを氷の上に置きます。
このステップは標準化されたキットから得られる試薬を使用して行われるように設計されている。実証済みのすべての手順は、製造元の指示に従って実行する必要があります。GEM生成の準備のために、チップホルダーにチップを入れ、メーカーのプロトコルに従って氷の上にセルマスターミックスを準備します。
マスターミックスの56.2マイクロリットルを33.8マイクロリットルのセルフサスペンションを含むチューブに加えます。チップを調製するために、まず使用しないウェルに50%グリセロールで。その後、セルマスターミックスの90マイクロリットルをウェル1に、40マイクロリットルのゲルビーズをウェル2に、270マイクロリットルの分配油を3に加えます。
チップをガスケットで覆います。チップをロードして単一セルコントローラで実行するには、まずトレイを取り出します。トレイにチップを入れる。
トレイを引き込み、再生を押します。完全な実行後、サンプルの100マイクロリットルを収集し、PCRチューブに入れ。PCRチューブをプリセット PCR マシンに配置し、キットに従って実行します。
実行後、GEはポリアデニル化mRNAから全長のバーコード化されたcDNAを含みます。チューブをマイナス20度で一晩置きます。ライブラリの構築、シーケンス、位置合わせ、および解析を進めます。
サンプルがシーケンス化され、原稿に記述されているように整列されたら、NCBI の GEO などのパブリック リポジトリにデータを格納します。これを行うには、提出者アカウントに登録します。まず、メタデータシートをダウンロードしてGEO提出を完了します。
プロジェクトの提出ごとに 1 つのメタデータ シートのみを含めます。スプレッドシートをディレクトリに配置します。次に、すべてのライブラリのセル Ranger カウント スクリプトから生成された生データ ファイルをディレクトリに追加します。
3 番目のフォルダーは、処理されたデータ ファイルです。すべてのライブラリのセル範囲カウントスクリプトから生成された処理済みデータファイルをディレクトリに配置します。GEO 送信者の FTP サーバー資格情報を使用して、3 つのコンポーネントすべてを含むディレクトリーを転送します。
細胞レンジャーを実行した後、分析準備ができた遺伝子バーコードマトリックスは、高度なバイオインフォマティクスを使用してさらに処理することができます。まず、バイオリンと散乱プロットを生成して、遺伝子の数、一意の分子識別子の数、ミトコンドリア遺伝子の割合を視覚化して細胞の二重および外れ値を識別するSeurat Rパッケージを使用して前処理量チェックを行いました。主成分、またはPCの選択のために、PC軸の標準偏差の高原を超えるPCが除外された肘のプロットが使用されました。
クラスタリングの解像度も操作されました。低解像度の場合、セル クラスターが少なくなり、各クラスターが定義されたセルの種類を表している可能性があります。高解像度は、セル集団のサブタイプ(移行状態)を表すセル確率を高くすることにつながった。
低解像度のクラスター設定は、特定のクラスター内で最も高発現の遺伝子を同定するために、発現ヒートマップのさらなる解析に使用されました。個々の候補遺伝子をtSNEプロット上で視覚化し、Seuratの特徴プロット機能を使用して、解読を可能にし、例えばマクロファージを表すクラスターがあるかどうかを確認することができた。クラスター2と4の両方がCD68、汎マクロファージマーカーを発現した。
他のパッケージは、品質管理のためのツールを提供します, 例えば, Monocle, 細胞の軌道を構築するために使用されるRパッケージ, 低品質の細胞を除去します, そして、すべての細胞間のmRNAの分布が対数正規であることを確認し、上限と下限の間に落ちています.次に、単一細胞を分類してカウントし、既知の系統マーカー遺伝子を用いて、目的のマーカーを発現する細胞を細胞型第1に割り当てた。細胞型1番は線維芽細胞であると判断した。
この集団は、線維芽細胞の発達軌道を構築するために評価された。この手順に従って、定量PCRのような他の方法は、その場でのハイブリダイゼーションにおいて、免疫者の化学を実施して、遺伝子発現結果の正確性を検証する必要があります。単細胞mRNAシーケンシングは、多くの異なる分野の研究者が細胞間の不均一性を探求し、ホメオスタシス中に異なる組織内の機能的ダイナミクスを同定する道を開き、これらは傷害または病気の発症後にどのように変化する可能性があります。
