Yeni sentezlenen DNA'nın EdU etiketlemesi ve Nanogold parçacıklarının gümüş ile güçlendirilmesi ve kromatinin ChromEM boyanması ile etiket tespiti ile hücredeki replikatif alanların elektron mikroskobik görselleştirmesi için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, oda sıcaklığında numune işleme için kromatinin en iyi yapısal korumasını sağlayan geleneksel glutaraldehit fiksasyonu ile yüksek kontrastlı ön gömme etiketlemesini sağlar. Bu protokol, Petri kabındaki kapaklarda büyüyen aderans hücresi için optimize edilmiştir.
10 mikro mol nihai konsantrasyonuna EdU ekleyin ve hücreleri istenen etiketleme süresi için inkübatöre yerleştirin. Etiketli hücreleri% 2.5 gluaradehidrat ile 100 milimol sodyum kakodilat çözeltisinde bir saat boyunca sabitleyin. Daha uzun sabitleme süresi EdU etiketlemesini olumsuz yönde etkileyebilir.
Glutaraldehit, numuneleri, PBS yıldızı olarak kabul edilen beş milimol magnezyum klorür ile desteklenmiş PBS ile durulayarak çıkarın. 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBS yıldızında% 1 Trione X-100 çözeltisi ile plazma zarlarını geçirgenleştirin, her biri beş dakika boyunca iki değişiklik yapın.
Bu çözelti ayrıca PBS yıldızı olarak da adlandırılır T.Numuneyi PBS yıldızı ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Her biri beş dakika boyunca beş değişiklik. Artık aldehit gruplarını PBS yıldızında 20 milimol glisin ile 10 dakika boyunca iki kez söndürün.
Numuneyi yarım saat boyunca %1 BSA ile PBS yıldızına yerleştirin. BSA'da bloke ederken, EdU tespiti için reaksiyon kokteylini hazırlayın. Bileşen ekleme sırası önemlidir.
EdU biyotin-azid konjugasyonu, reaksiyon kokteylindeki buharlaşmayı ve konsantrasyon kaymalarını en aza indirmek için nemli odada gerçekleştirilir. Nemli odayı hazırlayın. Kapak kaymasını, yukarı bakan bir hücre olacak şekilde para-film üzerine yerleştirin ve reaksiyon kokteylinin 50 ila 100 mikrolitresini kapak kapağına yerleştirin.
Reaksiyon oda sıcaklığında 30 dakika sürer. Numuneyi PBS yıldızı T'de, her biri beş dakika boyunca beş kez yıkayarak reaksiyonu durdurun. PBS yıldızı T'de yarım saat daha %1 BSA ile tekrar bloke edin.
PBS yıldızı T'de% 1 BSA ile streptavidin-Nanogold çözeltisi hazırlayın. Numuneyi yeni hazırlanmış nemli bir odada gece boyunca artı dört derecede streptavidin ile inkübe edin. Prosedür, EdU biyotin-azid konjugasyonu ile aynıdır.
Reaksiyonu durdurun ve numuneyi yıkayın, her biri 10 dakika boyunca beş kez PBS yıldızı T.Stabilize biyotin streptavidin kompleksi ek fiksasyon ile% 1glutaraldehit PBS yıldızı yarım saat boyunca. Deiyonize su ile yoğun yıkama ile glutaraldehit çıkarın. Artık aldehit gruplarını mililitre sodyum borohidrit başına bir miligram ile söndürün.
Tekrar iyice yıkayın. Bir sonraki adım, altın rotasında gümüş birikimi yoluyla Nanogold parçacıklarının boyutunu arttırmaktır. Karanlık oda etkinliğini en aza indirmek için ön karışımlar hazırlayın.
Numuneleri yıkama tamponu ile dengeleyin ve karanlık bir odaya geçin. Karanlık odada, yıkama çözeltisini hazırlamak için bileşenleri karıştırın ve numunelere uygulayın. Akasya tozu çözeltisi yüksek visiküllerdir.
Bu nedenle, bileşenleri karıştırırken, kabarcık ve köpük oluşumunu önlemek için tüpü yavaşça sallayın. Reaksiyon iki ila beş dakika sürer. En uygun reaksiyon süresini belirlemek için bir test çalışması yapmanızı öneririz.
Daha uzun inkübasyon süresi, spesifik olmayan bir gümüş birikimine neden olabilir. Reaksiyonu durdurmak için, numuneyi deiyonize suyun üç ila beş değişikliği ile hızlı bir şekilde durulayın. Bunu her biri beş dakika boyunca üç değişiklik daha izledi.
Gümüş nanopartikülleri osmiyum tetroksit tarafından çözünmeye karşı korumak için, numuneleri karanlıkta iki dakika boyunca% 0.05 tetrakloroaurik asit içinde inkübe edin. Deiyonize su ile iyice yıkayın. Bu aşamada, DNA içeren materyale ek kontrast eklenir.
Numuneyi DRAQ5 DNA boyası ile doyurun. Numuneye diamionobenzidin çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Kapak kapağını cam tabanlı Petri kabına taşıyın ve ters çevrilmiş mikroskop sahnesine yerleştirin.
640 nanometre kırmızı ışıkla çeşitli görüş alanlarını ışınlayın. Sol panel, DRAQ5'in tam fotoğraf ağartmasını gösterir. Sağ panelde, DAB çökeltisini gösteren iletilen ışıkta aynı görüş alanı görüntülenir.
Numuneleri deiyonize suyla yıkayın. Bir sonraki aşama duman başlığı altında yapılmalıdır. Kısmen indirgenmiş ozmiyum tetroksit çözeltisi hazırlanır.
Dikkat et. Bu madde oldukça uçucu ve toksiktir. Hazırlanan çözeltiyi numune üzerine uygulayın.
Bu aşamada, indirgenmiş osmiyum bileşikleri diamionobenzidin birikimleri ile reaksiyona girer ve DNA'nın kontrastını arttırır. Ozmiyum içeren çözeltiyi yerel yönetmeliğinize göre atın ve numuneleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Numune, bir dizi artan etanol konsantrasyonunda daha da dehidre edilir, ardından hücrelerin etanol reçine karışımları ile infiltrasyonu sağlanır.
Alkol reçine karışımını taze hazırlanmış saf reçine ile değiştirin. Uygun boyutta gömme kalıbını taze hazırlanmış bir reçine ile doldurun. Kapak kapağını, reçine dolu boşluğun üzerine aşağı bakan bir hücre ile yerleştirin.
Reçineyi 37 derecede 24 saat kürleyin. Sonra en az iki gün boyunca 60 derecede. Bir kapağın alt yüzeyinden reçineyi çıkarın.
Levhayı sıvı bir azot içine bırakın ve ardından kaynar suya aktarın. Cam ayrılmalıdır. Gerekirse tekrarlayın.
Işınlanmış görüş alanları, diamionobenzidin birikimi ve DAB boyaması nedeniyle açıkça görülebilmelidir. Demir testeresi veya başka bir uygun alet kullanarak ilgi alanını levhadan kesin. Kesiği ultramikrotom basit tutucuya yerleştirin.
Son blok kırpma için ultramikrotomu ayarlayın. Jilet bıçağını kullanarak piramit şeklindeki pillet'i hazırlayın. Piramidin üstündeki düz bir alanın büyüklüğü yaklaşık 400 x 200 mikron olmalıdır.
Hazırlanan piramidi ultramikrotom koluna monte edin ve bıçağı takın. Bölümleri hazırlayın. Kesit kalınlığı deneysel gereksinimlere uyacak şekilde ayarlanabilir.
EM tomografiyi hedefliyoruz. Bu yüzden yarı ince kesitler olarak da adlandırılan 250 nanometre kalınlığında kesitler hazırladık. Bölümleri bıçağın kenarından ayırın ve bir yuva ızgarasına monte edin.
Bir yuva ızgarası kullandık, etrafta olmak için bir milimetre yuvarlaktı, bir milimetre yan açıklıktı. Küçük açıklık boyutu, bölümlerin daha iyi stabilitesini sağlar. Numunelerin ızgarada kurumasını bekleyin.
Şu anda, bölümler gözlem için hazır. Izgarayı elektron mikroskobu numune tutucusuna yerleştirin. Numuneyi elektron mikroskobuna yükleyin.
Eğim serisini edinin. Memeli hücre çekirdeklerindeki replikasyon odakları, S-fazı ilerlemesine bağlı olarak farklı dağılım paternleri gösterir. Floresan olarak etiketlenmiş azid ile tıklama reaksiyonu ile doğrulanan başarılı EdU etiketlemesi, üstte glutaraldehit fiksasyonundan sonra heterojen hücre popülasyonunda tipik replikasyon paternini göstermektedir.
Streptavidin etiketlemesi glutaraldehitten etkilenebilir. Bu yüzden önce alttaki streptavidin nanogold ile aynı durumda floresan streptavidin boyamasını kontrol edin. Gümüş geliştirme prosedürünün iyi sonucu, bazı çekirdeklerin koyu kahverengi boyanması ve altta gösterilen çok solmuş sarı sitoplast boyasıdır.
Önceden gömme etiketlemenin avantajı, bölümleme için hücre seçme olasılığıdır. Bu aşamada mümkündür, çünkü etiketleme desenleri parlak bir alan mikroskobu altında görünür hale gelir. Uygun etiketleme, iyi ayrılmış çoğaltma siteleriyle sonuçlanır.
Ok ucu, DAB lekeli kromatin liflerini gösterir. Sağdaki arka plan etiketlemesi, mikron kare başına birkaç nanopartikülle sınırlıdır. Yarı ince kesitler tomografi için hazırdır ve altın nanopartiküllerin eklenmesini gerektirmez.
Replikasyonun etkin olduğu sitelerde kromatin organizasyonu çalışmaları için kullanılan tarif edilen yaklaşım. Kromatin ayrışmasının yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi de dahil olmak üzere kromatinin replikatif sonrası yeniden düzenlenmesinin analizi için. Ayrıca, büyük kromozomal alanların çoğaltılmış etiketlenmesi ve daha yüksek dereceli kromatin katlanması ve heterokromatin çalışmaları için kullanılır.
Bu görüntüleme tekniği, mikroskobik olmayan diğer yaklaşımlar tarafından üretilen veriler için bir referans noktası olarak da önemlidir. Yöntem, süper çözünürlük teknikleri de dahil olmak üzere korelasyonlu mikroskobik çalışmalara da yerleştirilebilir. Bu, kromatinin yüksek dereceli yapısı ve hücrenin çeşitli fizyolojik durumlarındaki dinamikleri üzerine yapılan çalışmalarda yeni ufuklar açmaktadır.
