Biz onların teknik yardım için Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin ederim. Bu çalışma Sağlık hibe DA023700 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilen ve XX DA023700-04S1 edildi

1. Beyin dilim hazırlık <ol><li> Transgenik fareler sodyum pentobarbital (&gt; 100 mg / kg, ip) ile anestezi uygulanmış ve son derece hızlı bir şekilde öldürülmüş ve beyinleri bir dondurulmuş ve oksijenli kesme çözelti içine ekstrakte edildi. </li><li> GFP gözlük fare beyni GFP ifade eden, görsel olarak taranması için kullanılır. </li><li> Kalınlığında 400 mikron İlköğretim somatosensoriyel kortikal bölümden sakkaroz içeren yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) bir vibratome ile kesilir. Dilimler önce 32 ° C &#39;de 30 dakika ila 1 saat için sakaroz içeren ACSF içinde inkübe edildi, ve ilk inkübasyon döneminden sonra, oda sıcaklığında kayıt ACSF aktarılır. İnkübasyon ve kayıt boyunca, dilimler sürekli olarak% 95 O2 5% CO2 ile kabarmış edilir. </li></ol> 2. Ekipman başlangıç Toplam sistem uygulama Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. <ol><li> Lazer soğutma sistemi ve elektrik tedarikçisi turne ised üzerinde lazer hazırlanıyordu. </li><li> Photostimulation kontrolü (tarama ayna sistemi, optik modülatör, elektronik obtüratör ve fotodiyot girişi amplifikatör dahil) ile ilgili tüm donanım açıktır. </li><li> Elektrofizyolojik teçhizatı (Multiclamp 700B amplifikatör ve mikromanipülatörler dahil) açıktır. Elektrofizyolojik kayıtlar, photostimulation ve dilim hazırlıkları görüntüleme mikroskop motorlu sahne üzerine monte edilmiş bir dilim perfüzyon odasında yapılır. </li><li> Görüntüleme kamerası (Retiga 2000, S-görüntüleme, Austin, Teksas) açıktır. Dilimler kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve görüntüleme sistemi ile epi-floresan optikler ile dik mikroskop (BW51X, Olympus) ile görüntülenmiştir. </li><li> Matlab tabanlı EPHUS yazılım ve Q-yakalama kamera yazılımı başladı. Ephus yazılımının bir özel modifiye versiyonu (Ephus, mevcut <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/ &lt;</a>/ A&gt;) photostimulation protokolleri kontrol ve photostimulation verileri elde etmek için kullanılır. </li><li> Sistemin açık olduğu sonra bir lazer photostimulation sistemi çalışan bir devlet de olup olmadığını görmek için kontrol etmelisiniz. 4x mikroskop objektif glutamat uncaging için UV yanıp teslim için kullanıldığı gibi, beyaz bir kağıt parçası sistem çalışırken lazer tarama desen gözlemlemek altında toplayabiliriz. </li></ol> 3. Dilim perfüzyon ayarlama <ol><li> Bir basınçlı perfüzyon sistemi dilim odasına kayıt ACSF beslemek için açıktır. Bakım odasında dilim yukarıda 2.0 mm sabit bir sıvı seviyesi sağlamak için alınır. </li><li> MNI-kafesli-glutamat stok çözeltisi bir kısım 0.2 mM glutamata kafesli bir konsantrasyon için ACSF dolaşan 25 mL ilave edilir. Deneme 5-6 saat sonra, banyo solüsyonu ve MNI-glutamat tazelenmiş olacak unutmayın. </li><li> Bir beyin dilim kayıt odasına taşınır. Bir görüntüleme s çalıştırabilirsinizistem dilim kalite kontrol ve anatomik birincil somatosensorial alan bulmak. Sonra dilim ısmarlama telli platin yüzük ile demirlemiş olan. Kayıtları için tasarlanmış beyin bölgesi üzerinde çapa koymak için dikkatli olun. </li></ol> 4. Tüm hücre yama klemp kayıt <ol><li> Cam elektrotlar (4-6 MΩ direnci) hücre etiketleme ve morfolojik tanımlama için% 0.1 biocytin içeren bir iç çözümü ile çekti ve doldurulur. </li><li> Yama kayıt gerçekleştirmek için, hücrelerin 60x objektif de görüntülenmiştir. İnhibitör hücre tipleri ilk tespit ve floresan / DIC Olympus mikroskop altında GFP ifade görselleştirme göre seçilir; kayıtlar sonradan kızılötesi DIC video izleme destekli görsel kontrol altında gerçekleştirilir. DIC ve floresan modları arasında geçiş birkaç kez hedef hücreye elektrot yaklaşırken GFP hücre konumu onaylamak için gerekli olduğunu unutmayın. </li><li&gt; Konvansiyonel patch-klemp teknikleri uygulanır. Elektrot pozitif basınç ile doldurulur, hedef hücre zarı üzerinde fark edilebilir bir gamze kurmak için yakın bir hücre yüzeyine taşınır, ve daha sonra hızlı bir şekilde negatif basınç oluşturan bir gigaseal ve video monitörü üzerinde akım enjeksiyon yanıtları izlemek süre içinde kırmak için uygulanır. </li><li> Içinde kırılma üzerine, DIC ve floresan modları altında 60x de hücre görüntüleri on-line doğrulanması için alınmaktadır. Photostimulation verilerin toplanması önce hiperpolarizan ve akım darbeleri depolarizan her hücrenin temel elektrofizyolojik özelliklerini incelemek için enjekte edilir. </li><li> Sonra stabil bütün hücre kayıtları iyi erişim direnci (genellikle MΩ &lt;20) ile elde edilir, mikroskop objektif 60x lazer tarama photostimulation 4x getirilir. 4x dilim görüntü elde edilir ve photostimulation siteler rehberlik ve tescil etmek için kullanılacaktır. </li></ol> 5. Lazer scaphotostimulation nning <ol><li> Photostimulation ve veri toplama parametreleri Ephus yapılandırma anahtarı modülü aktive ederek ayarlanır. Normal olarak, 1 saniye aralığında bir uyarıcı ile 1 ms lazer (20 mW) photostimulation eşleme için kullanılır. 10 kHz&#39;de örneklenmiş 1 saniye Veri izleri elde edilir. </li><li> 4x dilim görüntü Ephus arasında mapper modülünün içine yüklenir. Hücre soma konumu tanımlanır ve 16x16 desen (80 mikron x 80 mikron aralık) arasında photostimulation siteleri tüm kortikal katmanları kapsayan hücre konumu etrafında kurulur. </li><li> Kaydedilen nöronun uyarma profil akım kelepçe modunda photostimulation cevap olarak çivilenmesi yerle incelenmesi ile eşleştirilir. On-line ekran özellikleri ile Bizim kullanıcı dostu yazılım haritalama deneyler kolaylaştırır. </li><li> Lazer farklı azından tararken Yerel eksitatör devre bağlantıları kaydedildi hücreden eksitatör postsinaptik akımlar (EPSC) saptanması ile eşleştirilirkonumları. Hücre içe eksitatör akımları algılamak için gerilim kelepçe modunda -70 mV gerçekleştirildi. EPSC haritalar photostimulation desen döndürülmüş ile 2-3 kez tekrarlanır veya çevrileceği. </li><li> Opsiyonel: Yerel inhibitör devre bağlantıları da dışa inhibitör akımları algılamak için gerilim kelepçe modunda yakın 0 mV düzenlenen Kaydedilen hücreden inhibitör postsinaptik akımlar (IPSC) saptanması ile eşlenebilir. IPSC haritalama için sezyum yerine potasyum ile elektrot iç çözüm kullanmak en iyi olduğunu unutmayın. </li><li> Tüm fizyolojik deneyler tamamlandıktan sonra, elektrot yavaşça kaydedilen hücre kaldırılır. Beyin dilim gecede% 4 paraformaldehid dışarı alınır ve sabittir. Kaydedilen hücreler biocytin karşı lekeli. Hücre morfolojisi de Kaydedilen her hücre aslında başlangıçta hedeflenen GFP ifade internöron olduğunu onaylar konfokal veya epi-floresan mikroskobu ile incelenmiştir. </li></ol> 6. Photostimulatiyon veri analizi Bizim yeni geliştirilen metodoloji ve yazılım uygulaması 11 ham veri haritalarında photostimulation-uyarılmış sinaptik olayların tespiti ve ölçümü uygulanır. Şekil 2&#39;de örnek, renk kodlu haritalar Kaydedilen nörona sinaptik giriş deseni göstermek için inşa edilir. 7. Temsilcisi Sonuçlar: Elektrofizyolojik kayıt ve photostimulation eşleme Örnek sonuçlar, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Spesifik hücre tipleri inhibitör Hedefli kayıtları bilinen inhibitör hücre tiplerinde GFP ifade eden transjenik farelerin kullanılması ile mümkün kılınmıştır. Inhibitör internöron çeşitliliği göz önüne alındığında, GFP, intrinsik elektrofizyoloji ve morfolojik özellikleri (Şekil 2A) analizi nihai hücre tipi sınıflandırma ulaşmak için birleştirilir. Şekil 2B-C lazer tarama photostimulation yerel cortic geniş eşleme için izin verdiğini göstermektedirTek inhibitör nöronlar al devre bağlantıları. Ham veri haritası Şekil 2C&#39;de gösterilmiştir. Doğrudan uncaging cevaplar veri analizi (Şekil 2C) dışındadır. Kantitatif giriş haritaları, renk kodlu Şekil 2D-F &#39;de gösterilmiştir. Örneğin hızlı çivileme inhibitör internöron katman 4 ve daha derin katmanları güçlü eksitatör sinaptik girişi (EPSCs) aldı. Tanımlanmış kortikal yolları için hücrenin sinaptik giriş organizasyonu ile, biz kortikal bilgi işleme, muhtemel rolünü (örneğin, geri ve ileri beslemeli inhibisyon) anlaması mümkün. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> Şekil 1. Lazer tarama photostimulation Genel sistem enstrümantasyon. Bizim genel sistem photostimulation kontrolü, video görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt sistemleri oluşur. Bu LSP&#39;ler sisteminin tasarımı daha önce tarif 7,17 kabul etmiştir. Bir lazer ünitesi 355 nm UV las oluşturmak için kullanılırglutamat uncaging için er. Lazer ışını sistemimizin optik yol üzerinden yönlendirilir. Lazer yanıp söner (örneğin, 1 - 3 ms) Kısa süreler bir elektro-optik modülatör (yani, Pockels hücre) ve mekanik bir deklanşör kullanarak kontrol edilir. Lazer ışını güç bir nötr yoğunluk gradiyenti tekerleği ile modüle ve fotodiyot bir cam lamel ile lazer ışını küçük bir kısmını yönlendirme tarafından izlenir. Lazer tarama sistemi tarama aynalar, tarama lens, tüp objektif ve objektif lens bir XY çifti içerir. Aynalar bir tarama lens aracılığıyla lazer ışını teslim, sonra kiriş dikroik ayna aracılığıyla mikroskop girer ve ısmarlama bir UV-vericisi tüp mercek tarafından odaklanır. Bir kiriş daha sütunlu aksiyal çözünürlük azaltılması mümkün olduğu kadar iki-boyutlu olarak haritalama tutarak, aydınlatma huzme (konik olarak aksine) sağlamak üzere hedef bir mikroskop arka açıklığı underfills. 4x hedefi kapsamında, lazer ışını uncaging noktalar, her yaklaşmak oluştururng odak düzlemi (insert bakınız) yanal 153 mikron genişliğinde bir Gauss profili. Aynalar ve objektif arka diyafram objektif lens odak düzlemi farklı tarama yerlerde içine ayna konumları tercüme, eşlenik uçaklar olduğu gibi çeşitli lazer stimülasyon pozisyonları, galvanometre tahrikli XY tarama aynalar yoluyla elde edilebilir. Uncaging sırasında, tüm alanı kapsayan desenli siteleri değişken bir dizi son zamanlarda uyarılmış sitelerin civarı revisiting önlemek için nonraster, tesadüfi olmayan sırayla sırayla uyarılır. Daha ayrıntılı bilgi için Xu ve diğ. (2010) bakınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> Şekil 2. Fare primer duyusal korteks tabakası 4 bir GFP ifade hızlı çivileme interneuron yerel eksitatör devre bağlantıları haritalanması. A1 ve A2 60x altında hedeflenen hücrenin DIC ve GFP floresan görüntüleri göstermekyaşam beyin dilim objektif, A3 post-kayıt, sabit dilim biocytin boyama ile ortaya hücre morfolojisi gösterirken. A4, çeşitli güçlü intrasomatic akım enjeksiyon yanıt olarak hızlı çivileme inhibitör interneuron karakteristik kaydedilen GFP hücresi, bir ateşleme modellerini gösterir. B 16 x16 photostimulation siteleri (*) ile bindirilmiş dilim görüntü göstermek. Hücre konumu küçük kırmızı bir daire ile gösterilir. C hücre uyarıcı içe doğru akım tespit etmek için -70 mV tutulurken, B &#39;de gösterilen uyarım konumlardan photostimulation ile uyarılan tepki izleri bir dizi gösterilmektedir. Photostimulation yanıtların farklı formları genişletilmiş ve ayrı ayrı eklemek de gösterilmiştir 1 ve 2 lokasyonlarda izleri ile örneklendirilmiştir. Izleme 1 hücre gövdesi ve promximal dendritler üzerinde uncaging glutamat yanıtlar doğrudan bir örneği (kırmızı ok uçları ile gösterilir). 2. Diğer izleri eksitatör sinaptik tipik örnekleridiryanıtları (mavi) koymak. Doğrudan yanıtları ve sinaptik girdi onların genlikleri ve yanıt latansı ile ayırt edilebilir. D, E ve F ham verilerin her birinden ortalama girdi genlik C&#39;de gösterildiği map için sırasıyla ortalama EPSC genlik renk kodlu haritalar (16x16 siteleri), EPSC numaraları ve site başına ilk tespit EPSC gecikme, vardır stimülasyon sitesi aynı sitenin photostimulation yanıtı çıkarılır bazal spontan tepki ile, analiz penceresinde EPSCs arasında ortalama genlik. EPSCs ve varış zamanı veya site başına ilk tespit EPSC latans sayısı da ölçülür ve çizilir. Daha fazla bilgi için (Shi ve diğ., 2010) bakınız.

<ol>
	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons.">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li><li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity.">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li><li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex.">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li><li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex.">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li><li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin.">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li><li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction.">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Photostimulation tabanlı haritalama teknikleri etkin kortikal devrelerde analiz uygulanmıştır. Birçok farklı yerlerde presinaptik nöron kümeleri photostimulation ile postsinaptik nöron aynı anda kayıt eksitatör mekansal dağılımının kantitatif tedbirler sağladığından tüm hücre kayıt ile birlikte Lazer tarama photostimulation, tek nöronlara presinaptik giriş kaynaklarından laminer dağılımlarının yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar veya inhibitör girdiler. Bilinen inhibitör hücr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> transgenik fare çizgiler </td><td> Jackson laboratuvar veya diğer kaynaklardan </td><td></td><td> Xu ve Callaway (2009) &#39;e bakınız </td></tr><tr><td> GFP gözlük </td><td> TYD Ltd, Macaristan </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> Leica Sistemleri </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI kafesli glutamat (4-metoksi-7-nitroindolinyl-kafesli L-glutamat) </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> Cat No 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocytin </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> elektrot çektirmesi </td><td> Sutter Instrument, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> elektrotlar yapmak için cam tüpler </td><td&gt; </td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> 700B amplifikatör Multiclamp </td><td> Molecular Devices, Sunnyvale, </td><td> 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> dijital CCD kamera </td><td> Q-görüntüleme, Austin </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Araştırma mikroskobu </td><td> Olympus, Tokyo, Japonya </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UV lazer ünitesi </td><td> DPSS Lazerler, Santa Clara, CA </td><td> modeli 3501 </td><td></td></tr><tr><td> Lazer tarama phostimulation İçin Diğer Ekipmanlar </td><td></td><td></td><td> Xu ve ark bakın. (2010) </td></tr></tbody></table> Çözümler: <ul><li> Sakaroz-içeren dilim kesme için suni serebrospinal sıvı (ACSF) (mM: NaCl 85, 75 sakaroz, 2.5 KCl, 25 glikoz, 1.25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, 24 NaHCO 3). </li&gt; <li> Kayıt ACSF (mM olarak: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCI2, 2 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4 ve 10 glikoz) </li><li> Elektrot iç solüsyonu (mM olarak: 126 K-glukonat, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na ve 10 fosfokreatin, pH 7.2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

İnhibitör nöronlar kortikal fonksiyonu için çok önemlidir. Onlar tüm kortikal nöronal nüfusunun yaklaşık% 20 oluşturmaktadır ve daha 1-4 onların immunokimyasal, morfolojik ve fizyolojik özelliklerine göre farklı alt gruba ayrılabilir. Önceki araştırma inhibitör nöronların tek tek türleri içsel özellikleri hakkında çok şey ortaya olmasına rağmen, kendi yerel devre bağlantıları ile ilgili bilgi hala 3,5,6 oldukça sınırlıdır. Her nöron fonksiyonu kortikal devrelerde dahilinde eksitatör ve inhibitör sinaptik giriş şekillenmekte olduğu göz önüne alındığında, biz özel baskılayıcı hücre türleri için harita yerel devre bağlantıları için lazer tarama photostimulation (LSP) kullanıyoruz. Konvansiyonel elektrik stimülasyonu veya glutamat puf uyarımı ile karşılaştırıldığında, LSP&#39;ler ayrı ayrı kaydedilmesi nöronlar 3,7-9 kapsamlı haritalama ve yerel fonksiyonel girdi kantitatif analiz için izin benzersiz avantajlara sahiptir. Lazer Fotoğrafglutamat uncaging yoluyla uyarılması seçici geçit veya bir alt-laminer haritalama çözünürlük sağlar distal dendrit ve aksonlar aktive olmadan, perisomatically nöronları aktive eder. Büyük bir bölge üzerinde birçok uyarılması sitelerinden eşleme girişleri için LSP&#39;lerinin hassasiyeti ve verimliliği de kortikal devre analizi için uygundur. Burada tam hücreli yama yerel inhibitör devresi haritalama için sıkıştırma ile birlikte LSP&#39;lerinin teknik tanıtmak. Özel baskılayıcı hücre tipleri Hedefli kayıtları hedeflenen hücre tipleri tutarlı örnekleme ve kaydedilen hücre tiplerinin kesin kimlik sağlayan korteks 3,10, sınırlı inhibitör nöron toplulukları yeşil floresan protein (GFP) ifade transgenik farelerin kullanımı kolaylaştırdı . LSP&#39;ler haritalama gelince, biz, sistemin enstrümantasyon anahat deneysel işlem ve veri toplama tanımlamak, ve fare primer somatose devre haritalama bugünkü örneklerinsory korteks. Olarak bizim deneylerde gösterildiği, kafesli glutamat UV lazer fotoliz ile beyin dilim bir mekansal kısıtlı bölgede aktif hale gelir; eş zamanlı voltaj-klemp kayıtları photostimulation-uyarılmış sinaptik yanıtların tespitine izin verir. Hedeflenen nörona eksitatör veya inhibitör ya sinaptik giriş Haritalar potansiyeli presinaptik siteleri yüzlerce uyarmak için lazer ışını tarama tarafından oluşturulur. Böylece, LSP&#39;ler tekrarlanan deneyler aracılığıyla inhibitör nöronların belirli türleri üzerine çarpışan sinaptik girişlerin detaylı haritaların yapımı sağlar. Birlikte ele alındığında, photostimulation tabanlı tekniği nörologlar lokal kortikal devrelerin fonksiyonel organizasyon belirlemek için güçlü bir araç sunuyor.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation at JoVE.com

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Bu kağıt sınırlı inhibitör nöron toplulukları GFP ifade transgenik farelerin tüm hücre kayıtları ile photostimulation lazer tarama birleştiren bir yaklaşım getirmektedir. Tekniği spesifik inhibitör kortikal nöronların yerel sinaptik devrelerin kapsamlı haritalama ve kantitatif analiz için izin verir.

Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Bu kağıt sınırlı inhibitör nöron toplulukları GFP ifade transgenik farelerin tüm hücre kayıtları ile photostimulation lazer tarama birleştiren bir yaklaşım getirmektedir. Tekniği spesifik inhibitör kortikal nöronların yerel sinaptik devrelerin kapsamlı haritalama ve kantitatif analiz için izin verir.

Video: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Nörobilim

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.