Bu protokol, Colletotrichum fiorniae ve dönem çiçek enfekte diğer bitki patojenleri florokimyasal ipuçları zamansal dinamikleri değerlendirmek için ucuz ve uyarlanabilir bir sistem sağlar. Yeni zemin yağmur suyu toplama cihazları, kullanıcının doğal uyarıcıları ve patojen gelişimini etkileyen koşulları neredeyse gerçek zamanlı siteye özgü bir şekilde izlemesini sağlar. Bu yordamı, metin protokolünde açıklandığı gibi doğal olarak enfekte olmuş bir ana bilgisayardan Colletotrichum fiorniae kültürüyle başlatın.
Koloniler sporulate başladığında, başka bir V 8 Suyu agar üzerine bir yüksek yoğunluklu sporlama kültürü üretmek için hücre kültürü çanak içeren çizgi conidia. Büyüme yedi gün sonra, hafifçe conidial kitle döngü dokunarak yüksek yoğunluklu kültürden konidia küçük bir miktar toplamak için standart bir steril döngü kullanın. Steril deiyonize su 10 mililitre içeren 15 mililitrelik santrifüj tüp içine karıştırın.
Bu numuneyi 10 saniye boyunca girdaplayın. Standart bir pipet kullanarak, numuneyi daha fazla karıştırmak için defalarca yukarı ve aşağı daldırın. Daha sonra girdaplı numunenin bir damlasını hemositometrenin üzerine yerleştirin ve spor konsantrasyonlarını tahmin edin.
Beş mililitrelik son hacmi ile steril distile su mililitre başına 0,1 milyon conidia konsantrasyonu ayarlayın. Bu spor süspansiyon olarak adlandırılır ve sadece hemen önce her iki bioassay kullanmak için yapılır. Kloroform bazlı çiçek ekstraksiyonu gerçekleştirmek için tüm bileşenleri iki kez %95 etanol ile temizleyin.
Daha sonra her ekstraksiyon için kontaminasyonu önlemek için bileşenleri kloroform ile iki kez temizleyin. PTFE kaplı kapakları kloroform la temizlemeyin, çünkü bu kapaklar onlara zarar verir. Temizlendikten sonra, baş aşağı kuruması için bileşenleri bir kenara koyun.
Çiçek ve daha sonra kloroform ekleyerek bir beher dokuz parça kloroform bir parçası işlenmiş çiçekler birleştirin. Yavaşça 30 saniye boyunca girdap ve ikinci kabın içine paslanmaz çelik bir ekran ile süzün. İkinci kabın kloroform bazlı ekstresini cam kültür tüpüne dökün ve PTFE kapağını yapıştırın.
Buharlaşmayı önlemek için kapağı parafilmle sarın. Deneysel kullanıma kadar dört santigrat derecede ışık bozulmasını azaltmak için karanlıkta ortaya çıkan kloroform bazlı çiçek ekstresi saklayın. Çoğaltmasağlamak için çıkarmaları birden çok örnekle tekrarlayın.
Seçili her konum için bir toplama aygıtı oluşturmak için, bir püskürtme kabının altında delik açmak için matkap presine bağlı bir adım biti kullanın. Sonra sprey fincan ağzına deliğin üstünden düz bir çizgi kesti. Şimdi sprey kabın ağzında plastik kaplı tel iplik için yeterince büyük dört eşit uzaklıklı delik matkap.
Plastik kaplı tellerin bir ucunu serbest bırakarak takın. 50 mililitrelik bir santrifüj kapağı içine boya spreyveya fincan adaptörü iplik için yeterince büyük bir delik delin. Sızdırmayı önlemek için adaptör ipliklerini parafilm ile kapatın.
Bunu hem santrifüj kapağına hem de püskürtücü kabın dişli kısmına takın. Sonra çiftleştirilmiş 50 milimetrelik santimetrelik santimetrelik tüp ekleyin. Örnekleme konumu başına dört toplama aygıtı oluşturun.
Püskürtücü bardakları saplara sığacak şekilde esneterek cihazları seçili konumlara dağıtın. Püskürtücü kabının kesilmiş tarafını, diğer saplara bağlı plastik kaplamalı telleri kullanarak yukarı doğru yönlendirin. Bu çiçekler üzerinden geçen su yakalanır sağlar.
Kızılcık çiçeklerinden yağmur suyu toplamak için, ilk ısı bir metal sonda kullanarak hunin ağız etrafında sekiz eşit uzaklıkta delik delinme. Deliklerden dördüne büküm bağları yerleştirin. Diğer uçları o deliğin zıt konumuna takarak düzgün bir geçiş deseni oluştur.
Huniyi parafilm ile buhara sarın ve bir kenara koyun. Huniyi 50 mililitrelik bir santrifüj kapağına bir adım ucuyla sokacak kadar büyük bir delik aç. Hazırlanan huniyi santrifüj kapağına takın.
Yağış veya havai sulama sonra, kaldırmak ve santrifüj tüp alt tüp kısmı değiştirin. Yağmur suyu toplama tüpleri, bakteri ve diğer mantarlar gibi akıntıda harekete geçen doğal kirleticilerden bozulmaya yatkın oldukları için ıslatma olaylarından sonra hızlı bir şekilde değiştirilmelidir. Kültür yemekleri içinde kağıt diskler iki kat yerleştirin ve steril distile su iki mililitre ile ıslatın.
Daha sonra, iki mililitremikrosantrifüj tüpler steril distile su ve su bazlı çiçek ekstresi eşit hacimlerde karıştırın. Daha sonra hazırlanan iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplere spor süspansiyonunun eşit hacimlisini ekleyin. Ortaya çıkan hazırlık sulu bir tedavi karışımı olarak adlandırılır.
Kontrol için, çiçek özü kısmını atlayın ve conidial konsantrasyonları tutarlı tutmak için steril distile su ile değiştirin. Şimdi hücre kültürü çanak içinde ıslatılmış kağıt havlu üstüne önceden temizlenmiş cam kapakları yerleştirin. Bir coverslip merkezine sulu tedavi karışımı bir 40 mikrolitre damlacık yerleştirin.
Kontrol de dahil olmak üzere istenilen tedaviler için bunu tekrarlayın. Sonra hücre kültürü çanak kapatın. Tüm tedaviler ve çoğaltmalar dağıtıldıktan sonra, tüm çoğaltılmış hücre kültürü yemeklerini kapalı plastik bir kap içine yerleştirin ve karanlıkta 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, büyümeyi durduran ve dağı yarı koruyan damlacıklara 10 mikrolitre fiksatif ekleyin. Bir fiksatif eklendikten sonra, mikroskobik incelemeyi kolaylaştırmak için kapakların her birini cam mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirerek dikkatlice ters çevirin. Tüm kapaklar cam mikroskop slaytlar üzerinde olduğunda, yerleşmek ve kısmen 20 dakika boyunca akış kaputunda kuru maya bırakın.
Primer konidia, çimlenmiş konidia ve yeni oluşan ikincil konidia ve appressoria dahil olmak üzere kapak ta mevcut tüm conidia mevcut saymak. 3.808 milimetrelik bir alanı 400 kez büyütme veya 200 kez toplam çalışma. Bir laminar akış kaputunda, iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne iki eşit hacimli steril distile su ve bir hacim spor süspansiyon ekleyin.
Kloroform bazlı çiçek özü bioassays için kenara bu sulu tedavi karışımı ayarlayın. Bir duman başlık içinde, hazırlanan plastik hücre kültür çanak içinde bir cam coverslip üzerine bir Van T Cell yerleştirin. Hücrenin ortasına istenilen kloroform bazlı çiçek ekstresinin 33 mikrolitresini dağıtın ve kurumasını bekleyin.
Hücrenin duvarlarına dokunmayın. Kontrol tedavisi için, bakire kloroform ekleyin. Kloroform bazlı çiçek özü kuruduktan sonra, van T Hücresi'nin merkezine standart bir pipet ile hazırlanan sulu arıtma karışımının 99 mikrolitresini dağıtın.
Sonra tüm hücre kültürü yemekleri kapatın ve kuluçka. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, Van T Hücresine 15 mikrolitre fiksatif ekleyin ve yeterli mantar lekesi sağlamak için en az beş dakika bekleyin. Bu süre sonunda Van T Hücresini dikkatlice çıkarın.
Coverslip ters çevirme ve veri toplama adımlarını eskisi gibi gerçekleştirin. 24 saat sonra aşılama da C.fiornia mikroskobik değerlendirilmesi üzerine, steril distile su varlığında konidia karşılaştırma su bazlı çiçek ekstresi ikincil konidiyasyon ve appressoryum oluşumunda dramatik bir artış ortaya koymaktadır. Ancak, kloroform biyoassay steril distile su kontrolü kloroform bazlı özler karşılaştırırken ikincil konidiasyon olarak belirgin değildi.
Bunun yerine, C.fiorniae büyüme appressorial oluşumudoğru kaymıştır. Bu testte, steril distile su kontrolü ve kızılcık kloroform bazlı çiçek ekstraksiyonları görsel olarak sıfır, altı, 12 ve 24 saat sonra aşılama denetlenmiştir. Appressoryum oluşumu kloroform bazlı çiçek ekstresi altı saat başladı ve sürekli sonraki zaman noktaları boyunca arttı.
Bu sonuç, çiçeklerenfeksiyon yapıları oluşturmak için gerekli süreyi azaltmak bulgu destekler. Meyve çürüyen mantarlar için hastalık yönetimi genellikle çiçek zaman fungisit uygulamaları içerir. Burada, kızılcık birden fazla büyüme aşamalarında kızılcık kloroform bazlı özler görsel c.fiorniae üzerinde etkili yüzey mumlar için değerlendirildi 24 saat sonrası aşılama.
Haziran ayında toplanan yumurtalıklar, Temmuz ayında toplanan olgunlaşmamış meyveler ve Ağustos ayında ekim ayında toplanan meyveler ve steril distile su kontrolü appressorial oluşumu için denetlendi. Yumurtalık kloroform bazlı ekstreler, C.fiorniae yaşam döngüsünde çiçeklenmenin önemini gösteren appressorial formasyonun en büyük büyüklüğüne sahipti. Patojen bu protokolün en önemli bileşenidir.
Mantarlar denemeler arasında tutarlılık korumak için rutin taze medya taşınmalıdır. Kloroform ile herhangi bir çalışma güvenlik nedenleriyle bir duman başlık içinde yapılmalıdır. Bu malzeme ve cam hazırlanması, ekstraksiyon prosedürleri ve kloroform bazlı biyoassay iletkeniçerir.
Zaman noktaları, patojenler, çiçek yağmur suyu koleksiyonları veya konak ekstraksiyon kombinasyonları çeşitli konak-patojen etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir. Yağmur suyu toplama cihazları ve ilgili bioassays başkalarının çok sayıda yol sistemlerinde yağmur olayları sırasında seferber ev sahibi uyarıcılar ile çalışmak sağlayacaktır.
