이 프로토콜은 콜레토트라쿰 피오니아및 기간 꽃을 감염시키는 다른 식물 병원체에 대한 불소화학적 단서의 시간역학을 평가하기 위해 저렴하고 적응가능한 시스템을 제공합니다. 새로운 바닥 빗물 수집 장치는 사용자가 거의 실시간 현장별 방식으로 병원체 개발에 영향을 미치는 자연 각성제 및 조건을 모니터링할 수 있게 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자연적으로 감염된 호스트로부터 Colletotrichum 피오니아의 문화와 함께이 절차를 시작합니다.
식민지가 포자화되기 시작하면, 세포 배양 접시를 함유한 또 다른 V 8 주스 한천에 연속 콘디아를 사용하여 고밀도 포자 문화를 생성합니다. 7일간의 성장 후, 표준 멸균 루프를 사용하여 고밀도 배양으로부터 소량의 코니디아를 수집하여 고밀도 컬처에 가볍게 닿음으로써 곡성 질량에 닿는다. 멸균 된 탈수 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 이것을 저어주세요.
이 샘플을 10초 동안 소용돌이시다. 표준 파이펫을 사용하여 샘플을 더 혼합하기 위해 여러 번 위아래로 뛰어 내리게됩니다. 그런 다음 소용돌이 시료 한 방울을 혈류계에 놓고 포자 농도를 추정합니다.
5 밀리리터 최종 부피로 멸균 증류수의 밀리리터 당 010만 코니아로 농도를 조정합니다. 이것은 포자 현탁액이라고하며 생체 분석에서 사용하기 직전에만 이루어집니다. 클로로폼 기반 의 꽃 추출을 수행하려면 모든 구성 요소를 95 %의 에탄올로 두 번 청소하십시오.
그런 다음 각 추출에 대한 오염을 방지하기 위해 클로로폼으로 부품을 두 번 청소하십시오. PTFE 라이닝 캡을 클로로폼으로 청소하지 마십시오. 청소 후, 거꾸로 건조 구성 요소를 따로 설정합니다.
한 부분의 가공 꽃을 비커에 9개 부품클로로포형태로 결합한 다음 꽃과 클로로폼을 추가합니다. 스테인리스 스틸 스크린을 통해 30초 동안 부드럽게 소용돌이쳐 두 번째 비커로 스트레인합니다. 두 번째 비커에서 클로로폼 기반 추출물을 유리 배양 튜브에 붓고 PTFE 캡을 부착합니다.
증발을 방지하기 위해 파라필름으로 캡을 감쌉니다. 생성된 클로로폼 기반 의 꽃 추출물을 어둠 속에 저장하여 실험용으로 사용할 때까지 섭씨 4도에서 빛의 분해를 줄입니다. 복제를 제공하기 위해 여러 샘플로 추출을 반복합니다.
선택한 각 위치에 대한 수집 장치를 만들려면 드릴 프레스에 부착된 스텝 비트를 사용하여 스프레이 컵 하단의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 구멍 의 상단에서 스프레이 컵의 입으로 직선을 잘라. 이제 스프레이 컵의 입에 플라스틱 코팅 와이어를 스레드 할 수있을만큼 큰 4 개의 등거리 구멍을 드릴.
플라스틱 코팅 와이어의 한쪽 끝을 부착하여 한쪽 끝을 자유롭게 합니다. 페인트 스프레이 또는 컵 어댑터를 50밀리리터 원심분리기 캡 뚜껑에 실링할 수 있을 만큼 큰 구멍을 뚫습니다. 어댑터 스레드를 파라필름으로 밀봉하여 누출을 방지합니다.
원심분리기 캡과 분무기 컵의 나사 부분에 모두 부착합니다. 그런 다음 메이트 된 50 mm 원심 분리 튜브를 부착합니다. 샘플링 위치당 4개의 수집 장치를 만듭니다.
줄기에 맞게 분무기 컵을 구부려 선택한 위치에 장치를 배포합니다. 다른 줄기에 부착 된 플라스틱 코팅 와이어를 사용하여 분무기 컵의 절단 면을 위쪽으로 방향을 지정합니다. 이렇게 하면 꽃을 지나가는 물이 포획됩니다.
크랜베리 꽃에서 빗물을 수집하기 위해, 첫 번째 열은 금속 프로브를 사용하여 깔때기의 입 주위에 8 개의 등거리 구멍을 뚫습니다. 비틀기 넥타이를 구멍 의 네 개에 삽입합니다. 다른 끝을 해당 구멍의 반대 위치에 부착하여 깔끔한 교차 패턴을 형성합니다.
깔때기를 파라필름으로 스팀을 감싸고 따로 둡니다. 깔때기를 삽입할 수 있을 만큼 큰 구멍을 50밀리리터 원심분리기 캡에 단계비트로 드릴링합니다. 준비된 깔때기를 원심분리기 캡에 삽입합니다.
강우량 또는 오버 헤드 관개 후 원심 분리기 튜브의 바닥 튜브 부분을 제거하고 교체하십시오. 빗물 수집 튜브는 박테리아 및 기타 곰팡이와 같은 유출에 동원된 천연 오염 물질에서 분해되는 경향이 있기 때문에 습윤 후 신속하게 변경되어야 합니다. 문화 접시에 종이 디스크 2층을 놓고 멸균 증류수 2밀리리터에 담가 둡니다.
다음으로, 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에 멸균 증류수와 수성 꽃 추출물을 동등한 양으로 섞는다. 그런 다음 준비된 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에 포자 현탁액의 동일한 볼륨을 추가합니다. 결과 제제는 수성 처리 혼합물로 지칭된다.
컨트롤을 위해, 꽃 추출물 부분을 생략하고 멸균 증류수로 대체하여 냉간 농도를 일관되게 유지합니다. 이제 미리 청소된 유리 커버립을 세포 배양 접시 에 담근 종이 타월 위에 놓습니다. 수성 처리 혼합물의 40 마이크로리터 액자를 커버슬립의 중앙에 놓습니다.
제어를 포함한 원하는 치료를 위해 이것을 반복하십시오. 그런 다음 세포 배양 접시를 닫습니다. 모든 치료와 복제가 분배되면 복제된 모든 세포 배양 접시를 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 어둠 속에서 섭씨 25도에 배양하십시오.
미리 결정된 시간 지점에서, 산을 반 보존하는 방울에 고정 마이크로리터 10개를 추가합니다. 일단 고정이 추가되면, 조심스럽게 현미경 검사를 용이하게하기 위해 유리 현미경 슬라이드에 그들 각각의 물방울 측면을 배치 커버립을 반전. 모든 커버립이 유리 현미경 슬라이드에 있을 때, 20 분 동안 유동 후드에 정착하고 부분적으로 건조하도록 둡니다.
1 차 코니디아를 포함하여 커버 슬립에 존재하는 모든 코니디아를 계산, 발아 코니디아, 새로 형성 된 보조 코니디아, 뿐만 아니라 appressoria. 400배 배율 또는 총 면적 3.808 평방 밀리미터의 200배에서 작업합니다. 라미나르 플로우 후드에 2밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 두 개의 동일한 양의 멸균 증류수와 1부의 포자 현탁액을 추가합니다.
클로로폼 기반 의 꽃 추출물 바이오아세이 수성 처리 혼합물을 따로 설정합니다. 연기 후드에 반 T 셀을 준비된 플라스틱 세포 배양 접시 안에 유리 커버슬립에 놓습니다. 원하는 클로로폼 기반 꽃 추출물 33마이크로리터를 세포 중앙에 분배하고 건조시 좋습니다.
셀의 벽을 만지지 마십시오. 제어 치료를 위해 처녀 클로로폼을 추가하십시오. 클로로폼 기반 의 꽃 추출물이 건조되면, 반 T 셀의 중앙에 표준 파이펫과 준비 된 수성 처리 혼합물의 99 마이크로 리터를 분배.
그런 다음 모든 세포 배양 접시를 닫고 배양하십시오. 미리 결정된 시간 지점에서, 반 T 셀에 고정제 15 마이크로리터를 추가하고 적절한 곰팡이 염색을 보장하기 위해 적어도 5 분 동안 앉을 수 있습니다. 그 시간 이후에는 반 T 셀을 조심스럽게 제거하십시오.
이전과 같이 커버슬립 반전 및 데이터 수집 단계를 수행합니다. 접종 후 24시간 후 C.fiorniae의 현미경 평가시, 멸균 증류수와 수성 꽃 추출물이 있는 코니디아를 비교하면 이차 조정 및 압프레소리움 형성이 급격히 증가하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 이차 조정은 클로로폼 바이오라세이 멸균 증류수 조절을 클로로폼 계 추출물과 비교할 때 명백하지 않았다.
오히려 C.fiorniae 의 성장은 압제 형성으로 이동했습니다. 이 분석에서 멸균 증류수 제어 및 크랜베리 클로로폼 기반 꽃 추출은 0, 6, 12 및 24 시간 후 접종에서 시각적으로 검사되었습니다. Appressorium 형성은 클로로폼 기반 의 꽃 추출물에서 6 시간에서 시작하여 후속 시간 지점 전체에 걸쳐 꾸준히 증가했습니다.
이 결과는 꽃이 감염 구조물을 형성하는 데 필요한 시간을 줄이라는 것을 찾는 것을 지원합니다. 과일 썩어가는 곰팡이에 대한 질병 관리는 종종 꽃 시간 살균제 응용 프로그램을 포함한다. 여기서, 크랜베리의 다중 성장 단계로부터의 크랜베리 클로로폼 계 추출물은 접종 후 24시간 후에 C.fiorniae에 효과적인 표면 왁스를 시각적으로 평가하였다.
6월에 채취된 난소, 7월에 채취한 미숙한 과일, 8월에는 10월에 수확된 과일을 수확하고, 멸균 증류수 제어가 압제 형성을 위해 검사되었다. 난소 클로로폼 기반 추출물은 C.fiorniae의 수명 주기에서 꽃의 중요성을 나타내는 appressorial 형성의 가장 큰 크기를 했다. 병원체는 이 프로토콜의 가장 중요한 구성 요소입니다.
곰팡이는 시험 사이의 일관성을 유지하기 위해 정기적으로 신선한 미디어로 이동해야합니다. 클로로폼을 가진 모든 작업은 안전상의 이유로 연기 후드로 수행해야 합니다. 여기에는 재료 및 유리 제품 준비, 추출 절차 및 클로로폼 기반 바이오아세이의 전도도가 포함됩니다.
시간 지점, 병원체, 꽃 빗물 수집 또는 숙주 추출의 조합은 다양한 숙주 병원체 상호 작용을 평가하는 데 활용할 수 있습니다. 빗물 수집 장치 와 관련 바이오 아세이션은 다른 사람들이 수많은 경로 시스템에서 비 이벤트 중에 동원 된 호스트 각성제와 함께 작업 할 수 있게합니다.
