Name: designing microfluidic devices for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli at JoVE.com

This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.

1. Chip Tasarım ve İmalat <ol><li> Beraberlik desenleri ticari yazılım 24 kullanılarak PMMA yüzeyleri ve çift taraflı bantlar üzerinde kesip çıkartılacak. <ol><li> Beş kültür alanlarında (Şekil 1A ve 1B) her ucunda değişen genişliğe sahip bir &quot;Noel ağacı&quot; desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve kayma gerilmeleri etkilerini incelemek için. </li><li> Tuz köprüleri için iki tane daha akışkan kanalları (Şekil 2A ve 2B) ile &quot;Noel ağacı&quot; desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve elektrik alanların etkilerini araştırmak. </li></ol></li><li> Çizici PMMA levha veya CO 2 lazer Scriber içine ilgili dosyayı yükleyerek bir çift taraflı bant üzerinde bireysel bir desen. <ol><li> Lazer Scriber açın ve bilgisayara olan bağlantısını kontrol edin. desen açın ticari yazılımı kullanılarak kesilip edilecek. </li><li> PMMA levha ya da bir çift taraflı bant o yerleştirinScriber aşamasında n üst. Kalibrasyon bar ve görünür He-Ne lazer kullanarak gerekirse CO 2 lazer odağı ayarlayın. </li><li> PMMA levha veya banda ablasyon için Scriber içine desen yükleyin. </li><li> , Desenli levha veya bant Pick up istenmeyen parçaları kaldırmak ve azot üfleme ile yüzeyi temizleyin. Not: PMMA tabakanın kalınlığı 1 mm, ve çift-taraflı bant olduğu 0.07 mm ya da 0.22 mm &#39;dir. </li></ol></li></ol> 2. Chip Meclisi <ol><li> süper yapıştırıcı ile, üst vida konuları ve delikleri aynı hizaya getirerek çip en üst katmana (ortada vida dişleri uzunluk x genişlik x yükseklik = 10 mm x 10 mm x 5 mm) akrilik adaptörleri eklemek -En katmanı. Bu adaptörler giriş / çıkışları ve tuz köprüsü konnektörleri orta olarak hizmet vermektedir. </li><li> Laminer akış kaput içinde mikroakışkan çip takılacak. </li><li> Kimyasal kayma gerilmesi mikroakışkan çip (CSS chip) birleştirin. <ol><li> birttach tarif çift taraflı bant 2 adet kullanılarak tarif PMMA levhalar 3 yaprak. (Şekil 1A ve 1B). </li><li> çip altına 0.07 mm kalınlığında çift taraflı bant bir parça daha ekleyin ve 10 cm çapında Petri kabı çipi takın. </li><li> gece boyunca vakum odasında montaj çip koyun. </li></ol></li><li> Kimyasal-elektrik alan yonga (CEF chip) monte etmek için, kalınlığı bir çift taraflı bant PMMA levha takmak = 0.22 mm (Şekil 2A ve 2B). <ol><li> bant bu aynı parça kullanarak bir 10 cm çapında Petri kabı tarif PMMA levha ve çift taraflı bant takın. </li></ol></li><li> kaput içinde monte çip bırakın ve sterilizasyon için 30 dakika süreyle UV maruz kalmaktadır. </li><li> plastik tüpler ve parmak sıkı fındık üzerinden iki 3 ml&#39;lik şırınga girişleri bağlayın. Bir plastik tüp ve bir parmak sıkı somun vasıtasıyla atık tüpüne prizine takın. NOT: Otoklavkullanımdan önce, 15 dakika boyunca 121 ° C &#39;de, tüm borular ve fındık. </li><li> Yavaş yavaş PBS ile Başbakan akışkan kanallarına şırınga pistonu bastırın. kabarcıklarını çıkarmak için ileri ve geri şırınga itin. </li><li> % 5 CO2 altında 37 ° C&#39;de gece boyunca bir inkübatör içinde cipsleri. Not: Bu iki adım çip içinde kalan kabarcıklar çip yıkayın ve kaldırmak amaçlanmaktadır. </li><li> kuluçka çipi alır. </li><li> CEF çip elektrik alanların oluşturulması için agar tuz köprüleri hazırlayın. <ol><li> Bir mikrodalga kullanılarak 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tamponu içinde% 3 düşük erime noktası agaroz eritilir. </li><li> çözüm aşamalı tuz köprüsü kanala agaroz enjekte edilir ve çözüm katılaşır önce elektrotlar eklemek. </li><li> boru şeklindeki fındık içine gümüş / gümüş klorür elektrotlar yerleştirin. </li></ol></li><li> Dulbecco&#39;nun Modifiye EagleR (enjektör pompaları şırınga bağlayın ve sürekli kültür ortamı akış17; 20 ul bir akış hızında, 10 dakika boyunca akışkan kanal içine ortamıdır, DMEM) / dakika PBS yerine. </li></ol> 3. Hücre Hazırlama ve Deneysel Kurulum Not: Pre-sıcak 1X PBS, kullanmadan önce, bir 37 ° C su banyosu içinde kültür ortamı (DMEM artı FBS) ve tripsin. <ol><li> Plaka 2 x 10 5 hücre akciğer kanseri CL1-5 DMEM artı% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte 10 santimetrelik bir petri tabağına 25,26. % 90 birleştiği kadar 37 ° C &#39;de% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde inkübe hücreleri. </li><li> orta aspire ve önceden ısıtılmış 1x bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. hücrelere% 0.05 tripsin tampon maddesi 2 ml ilave edilir ve hücreleri ayırmak için 37 ° C &#39;de 2 dakika ile 3 bekleyin. </li><li> 15 ml&#39;lik steril bir santrifüj tüpüne aktarılır ve hücreler tüp içine kültür ortamı 6 ilave edin. Yavaşça karıştırma tüp ters bir hemocytomete hücre sayısını saymak için hücre ihtiva eden bir ortamda 5 ul almakr. </li><li> 300 x tüp santrifüj 5 dakika boyunca örn. Kültür ortamının 1 ml 10 6 hücre askıya alma ve 1 ml şırınga içinde, hücre içeren ortam yerleştirin. </li><li> prizden mikroakışkan çip içine hücre içeren orta aşılamak ve çözüm beş kültür alanlarında aracılığıyla tüm dağıtır emin olun. 2 saat boyunca 37 ° C &#39;de% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde çip inkübe edin. </li></ol> 4. Deneysel Kurulum <ol><li> kuluçka çip alın ve şeffaf indiyum kalay oksit (ITO) cam ısıtıcı üstüne yerleştirin. NOT: İTO cam termal coupler geribildirim yoluyla 37 ± 0.5 ° C sıcaklığı korumak için bir oransal-integral-türev (PID) denetleyiciye bağlı İTO ısıtıcı ve çip arasındaki sıkı kenetlenmiş. </li><li> Hücre göçü veya sabit bir XY takibi için bir ters mikroskop motorlu bir XY üst yonga ısıtıcı montaj koyunROS üretiminin ölçülmesi için bir ters flüoresan mikroskop. </li><li> (Kültür ortamı içinde çözülmüş) göreli konsantrasyonları 0 ve 1 arasında bir kimyasal çözeltilerin 5 ml ile iki şırınga dolgu farklı kimyasal konsantrasyonları oluşturabilir ve istenen akış hızlarında çip içine pompalamak için: CSS çipte, 0.3 ml &#39;lik bir akış hızında 1 saat / dk; İlk 20 dakika boyunca 20 ul / dk&#39;lık bir akış oranında CEF çip ve bir 120 dakika (toplam süresi = 2 saat) 20 ul / saat akış hızında. </li><li> CEF çipte, dijital tek lensli refleks yoluyla, kültür alanlarında 2 için her 15 dk içinde görüş belli bir alanda (FOVs) içinde (DSLR) fotoğraf makinesi, hücre göçü, mikroskobun XY fotoğraf çekmek tekrarlamak için programı izlemek için hr. </li><li> ROS üretiminin ölçülmesi için, flüoresan bazlı göstergesi 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diasetat (2&#39;-7&#39;-DCFDA) kullanın. <ol><li> Moleküler biyoloji sınıf di 10 mM 2&#39;-7&#39;-DCFDA stok hazırlamametil sülfoksit (DMSO). Sadece serumu (DMEM 5 mcM) olmadan DMEM DCFDA seyreltin. Potansiyel deasetilaz arka plan sinyallerini artırmak ve hücrelerde sinyalleri azaltabilir. </li><li> CSS çip veya CEF çip EF uyarıcının 2 saat sonra kesilme baskısı uyaran 1 saat sonra, 20 ul / dk&#39;lık bir akış oranı için de çip halinde 2&#39;-7&#39;-DCFDA (DMEM 5 uM) pompa ilk 20 dakika ve 20 dakika boyunca 20 ul / saat arasında bir akış hızı. Yıkama için, 20 dakika boyunca 20 ul / saat akış hızı ile yonga içine DMEM pompa. </li><li> floresan şiddetleri analiz etmek için, kültür alanlarında bazı FOVs arasında, bir şarj-kuplajlı aygıt (CCD) kamera ile Fotoğraflar al. </li></ol></li></ol> Kimyasal Konsantrasyonlarına, Kesme Zoru ve Elektrik Alanlar 5. Hesaplamalar <ol><li> CSS çip ve CEF çipi hem de, beş kültür alanlarında kimyasal konsantrasyonlarının hesaplamak. Örneğin, concentr ve H2O 2 enjekteations 0 ve iki giriş 200 uM, 0, 25, 100, 175 ve 200 uM oluşturulacak konsantrasyonları. NOT: Tüm sıvılar bölünmüş akışı o düzgün ve eşit çatal etrafında üstlenerek, beş kültür alanlarında göreli konsantrasyonları sırasıyla, 0, 1/8, 1/2, 7/8, ve 1 bulunmaktadır. </li><li> CSS yongası kullanılarak kültür alanlarının her birinde kayma gerilmesi (τ) hesaplamak <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> Q, akışkan viskoziteli η debisi, 27, H kanalının yüksekliği, w kanalının genişliğidir. NOT: Her girişine (S = 0.12 ml / dakika, her bir kültür alanı) Q = 0.3 ml / dk ile η = 0.0008 Pa s kültür ortamı, h = 1 mm, ve W = 1 ~ 4 mm için, kayma gerilmesi 0,0192 Pa 0,0048 Pa (4 mm genişliğinde bölge) (1 mm genişliğinde bölge) arasında değiştiği hesaplanmıştır. </li><li> İçindeCEF çip, σ kültür ortamı elektriksel iletkenlik, ben akışkan kanal boyunca akan elektrik akımı olan E = I / (σA eff) (Ohm yasası) kullanarak kültür alanlarının her birindeki EF gücünü hesaplamak ve A eff kanalın etkin bir kesit alanıdır. Not: kullanma σ = 1.38 Ω -1 m-1 kültür ortamı ve A eff = 0.22 ila 2 mm (genişlik = 1 mm ve yükseklik = 0.22 mm), EF gücü E (mV / aa) = I (olarak hesaplanır A) 3.3 × 10 6 ×. <ol><li> Şekil 2D&#39;de gösterildiği gibi, dört (8 + 35 + 8) segmentler ile bir (5 + 35 + 5) kademeli bir beş C-kesitli devreler gibi eşdeğer devre tedavi. NOT: Kirchhoff gerilim kanunu ve Ohm yasasına göre bu paralel devre analiz ederek, beş kültür boyunca akan akımlardırBen 1 alttan üste I 5 üzerinden gibi, ben (bölge 1) civarında 0.49 olarak hesaplanır, 0.25 I (bölge 2), 0.13 I (bölge 3), 0.08 I (bölge 4), ve 0.05 I (bölge 5), sırası ile, l), toplam akım (DC olduğu. 0.157 mA, 254 EF, 130, 67, 41 ve 26 mV / mm, uygulanan DC beş kültür alanlarında oluşturulur. Not: mikroakışkan ağ basitleştirilmiş elektriksel analiz için tüm akışkan segmentleri uzunluklarına orantılı direnç direnç olarak kabul edilmektedir. </li></ol></li></ol> 6. Veri Analizi Not: Veri analizi ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. <ol><li> ROS üretimi analiz edin. <ol><li> ImageJ yazılımı çalıştırın. Bir floresan resim yüklemek için &quot;Dosya&quot; → Aç gidin analiz edilecek. </li><li> im değiştirmek için &quot;Resim&quot; → &quot;Tip&quot; → &quot;16-bit&quot; gitgri ölçekli yaş. </li><li> Bir hücreyi içine bir çokgen çizmek. Hücrenin ortalama floresan yoğunluğu ölçmek için → &quot;Tedbir&quot; &quot;Analiz&quot; gidin. </li><li> Üç bağımsız deneyin en az 50 hücrelerinden yoğunluklarını toplamak ve ortalamanın standart hatası (SEM) ile, ortalama yoğunluğunu hesaplamak için 6.1.3 tekrarlayın. </li><li> Her bir deney koşulu için 6.1.1-6.1.4 tekrarlayın. </li></ol></li><li> Hücre Göç analiz edin. <ol><li> ImageJ yazılımı çalıştırın. zaman = 0 alındığı bir resim yüklemek için &quot;Dosya&quot; → Aç gidin analiz edilecek. </li><li> Bir hücreyi içine bir çokgen çizmek. (X 1, y 1) olarak hücrenin kütle merkezini ölçmek için → &quot;Tedbir&quot; &quot;Analiz&quot; gidin. </li><li> 6.2.1- 6.2.2 = anda t almak başka bir görüntüden aynı hücrenin kütle merkezi (x 2, y 2) ölçmek için tekrarlayın. </li><li> ve (mm / hr) göç oranını hesaplamakBu hücresi, <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> Üç bağımsız deneyden en az 50 hücrelerinden göç oranlarını toplamak ve ortalama standart hata (SEM) ile ortalama göç oranını hesaplamak için 6.2.1-6.2.4 tekrarlayın. </li><li> 6.2.2 ve 6.2.3 itibaren, kosinüs İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin olarak bu hücrenin göç Yönetme hesaplama veya <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> , Θ (pozitiften negatife) uygulamalı EF vektörü arasındaki açı ve hücrenin (Şekil 2G) son pozisyonuna baştan vektörü olduğu. </li><li> Üç bağımsız deneyin en az 50 hücrelerinden geçiş Yönetme toplamak ve ortalamanın standart hatası (SEM) ile, ortalama geçiş Yönetme hesaplamak 6.2.6 tekrarlayın. </li><li> SEM ile ortalama göç oranı ve her deneysel koşul için SEM ile ortalama göç Yönetme hesaplayın. NOT: Bir yönetme+1 Tüm hücreleri katoda doğru göç olduğunu gösterir ve bir -1 değeri tüm hücreleri anot doğru göç olduğunu gösterir. rasgele hareket eden hücreler, bir grup yönetme 0 civarındadır. </li></ol></li><li> Hücre Hizalama analiz edin. <ol><li> ImageJ yazılımı çalıştırın. Bir resim yüklemek için &quot;Dosya&quot; → &quot;Aç&quot; git analiz edilecek. </li><li> bir elips olarak hücre tedavisinde ve bir hücrenin uzun ekseni belirtmek için bir çizgi çizin. Hat ve yatay EF yönü arasındaki β açıyı ölçmek için → &quot;Tedbir&quot; &quot;Analiz&quot; gidin. </li><li> Üç bağımsız deneyden en az 50 hücrelerinden p toplamak için 6.3.2 tekrarlayın ve hesaplamak ortalama kosinüs β ortalama standart hata (SEM) ile. </li><li> Her bir deney koşulu için 6.3.1-6.3.3 tekrarlayın. NOT: +1 p cos A tüm hücreleri uygulamalı EF paralel hizaya belirten ve 0 değeri tüm hücreleri perpendicularl hizaya olduğunu gösteriruygulamalı EF y. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier.">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2, (2008).</li><li>Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Chromatographic+Air+Analyzer+Fabricated+on+a+Silicon-Wafer.">Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer.</a> Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li><li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreceptors+in+bacteria.">Chemoreceptors in bacteria.</a> Science. 166, 1588-1597 (1969).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Kao, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+chemotaxis+of+lung+cancer+cells+by+using+electric+fields+in+a+microfluidic+device.">Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device.</a> Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).</li><li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator.">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab Chip. 5, 611-618 (2005).</li><li>Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+electrical+stimulation+promotes+the+speed+and+accuracy+of+motor+axonal+regeneration.">Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration.</a> J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+electric+fields+in+embryos+during+development,+regeneration+and+wound+healing.">Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing.</a> Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).</li><li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+cell+behavior+electrically:+Current+views+and+future+potential.">Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential.</a> Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).</li><li>Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+and+wound+healing:+experimental+methods+to+study+electric+fields+as+a+directional+signal+for+cell+migration.">Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration.</a> Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).</li><li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip.">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li><li>Yan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+A549+Cells+Migrate+Directionally+in+DC+Electric+Fields+With+Polarized+and+Activated+EGFRs.">Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs.</a> Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+T+lymphocytes+migrate+toward+the+cathode+of+DC+electric+fields+in+microfluidic+devices.">Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices.</a> Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+electrotaxis+in+vitro+and+in+vivo.">Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+Guiding+Migration+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li><li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrical-stimulated+wound-healing+chip+for+studying+electric+field-assisted+wound-healing+process.">In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process.</a> Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).</li><li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds.">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6, (2012).</li><li>Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+device+for+studying+cell+migration+in+single+or+co-existing+chemical+gradients+and+electric+fields.">Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields.</a> Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).</li><li>Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+chemical+and+electrical+stimulation+on+lung+cancer+cells+using+a+multichannel-dual-electric-field+chip.">Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip.</a> Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).</li><li>Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+studying+the+production+of+reactive+oxygen+species+and+the+migration+in+lung+cancer+cells+under+single+or+coexisting+chemical/electrical+stimulation.">A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation.</a> Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).</li><li>Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stresses+and+antioxidant+concentrations+on+the+production+of+reactive+oxygen+species+in+lung+cancer+cells.">Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells.</a> Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).</li><li>Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-write+laser+micromachining+and+universal+surface+modification+of+PMMA+for+device+development.">Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development.</a> Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).</li><li>Chen, J. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+in+invasion+by+a+lung+cancer+model.">Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model.</a> Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).</li><li>Shih, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapsin+response+mediator+protein-1+and+the+invasion+and+metastasis+of+cancer+cells.">Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells.</a> J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).</li><li>Fried, L. E., Arbiser, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honokiol,+a+Multifunctional+Antiangiogenic+and+Antitumor+Agent.">Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent.</a> Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).</li><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+damage+to+animal+cells.">Hydrodynamic damage to animal cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).</li><li>Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbulent+fluid+shear+stress+induces+vascular+endothelial+cell+turnover+in+vitro.">Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).</li><li>Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+process+stress+on+suspended+anchorage-dependent+mammalian+cells+as+an+indicator+of+likely+challenges+for+regenerative+medicines.">The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines.</a> Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).</li><li>Chin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cells+under+different+pulsatile+shear+stresses+and+glucose+concentrations.">Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations.</a> Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).</li><li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field.">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

PMMA esaslı cips daha karmaşık yumuşak litografi gerektiren PDMS tabanlı çipleri ile karşılaştırıldığında daha ucuz ve daha kolay yöntemlerdir lazer ablasyon ve yazma kullanılarak imal edilir. mikroakışkan çip tasarladıktan sonra, imalat ve montaj sadece 5 dakika içinde yapılabilir. dikkat deneyi gerçekleştirirken ödenmesi gerektiğini bazı kritik adımlar vardır. İlk &quot;birleştirme&quot; bir konudur. Adaptör çipin en üst tabakaya düzgün yapıştırılmış olmalıdır. Çok fazla uy...

In vivo hücreler ekstrasellüler matriks (ECM), karbonhidratlar, lipidler ve diğer hücreleri dahil biyomoleküllerin çeşitli çevrili içinde. Bunlar çeşitli büyüme faktörleri kimyasal degradeler için ECM ile etkileşimler ve yanıtları mikro çevresel uyaranlara yanıt vererek işlerlik. Hücre ve reaktiflerin tüketimi büyüktür ve hücre ortamı (dışı dolaşım) statik yetiştiği Geleneksel olarak, in vitro hücre çalışmaları Hücre kültür tabaklarında yürütülmektedir. Son zamanlarda, akışkan bileşenleri ile entegre mikro fabrikasyon cihazlar daha kontrol edilebilir bir şekilde hücre çalışmaları için alternatif bir platform haline gelmiştir. Bu tür cihazlar hücreleri ve reaktifler tüketimini en aza indirirken, kimyasal ve fiziksel uyaranlar kesin bir mikro-ortam yaratma yeteneğine sahiptir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan yapılabilir (PDMS) polimerleri, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polyethylenetereftalat (PET) 1-3 alt tabakalar. PDMS tabanlı cihazlar uzun vadede hücre kültürü ve çalışmalar için uygun hale, şeffaf biyolojik olarak uyumlu ve gazlara karşı geçirgendir. PMMA ve PET yüzeyler, lazer ablasyon ve yazma kullanılarak işlenecek ucuz ve kolaydır. Mikroakışkan cihazlar hücreleri, farklı kimyasal ve fiziksel uyarıcılara maruz kalan bir sabit ve kontrollü mikro ortam hücreleri sağlamalıdır. Örneğin, mikro-akışkan fiş hücrelerinin kemotaksisini incelemek için kullanılır. Bunun yerine Boyden odası ve kılcal 4,5 bu minyatür akışkan cihazlar hücrelerin davranışlarını 1,6,7 çalışmak için kesin kimyasal degradeler oluşturabilir istihdam geleneksel yöntemlerin. Başka bir örnek elektrik alanları (EFS), bir fenomen adlı electrotaxis altında hücrelerin yönlü göç incelemektir. Hücrelerin Electrotactic davranışları, rejenerasyon 8, embriyonik gelişme 9 ile ilişkili olduğu bildirilmiştirve 10,11 yara iyileşmesi. Ve birçok çalışma, 14,15 lenfositlerin, kanser hücreleri 12,13 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin electrotaxis araştırmak için lösemi hücrelerini 11 yapıldı ve hücreler 16 kök edilmiştir. Geleneksel olarak, petri ve örtücü camlar EF&#39;lerini 17 üretilmesi için electrotactic odaları oluşturmak için kullanılır. Böyle basit kurulumları orta buharlaşma ve kesin olmayan EF sorunlarını teşkil, ama onlar kapalı, iyi tanımlanmış akışkan kanalların 12,18,19 ve mikroakışkan cihazlar aşılabilir. sistematik hassas, kontrol kimyasal ve elektriksel uyaranlar altında hücresel yanıtları incelemek için, aynı anda birden fazla uyaranlara hücreleri sağlayabilen mikroakışkan cihazlar geliştirmek için büyük kullanım olacaktır. Örneğin, Li ve diğ. Tek oluşturma veya kimyasal geçişlerini ve EF&#39;lerini 20 coexisting için PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz bildirdi. Kao ve diğerleri. devEF 6 akciğer kanser hücrelerinin kemotaksisini modüle benzer bir mikroakışkan çip eloped. Ayrıca, verimlilik, Hou ve ark artırmak için. tasarlanmış ve 8 farklı kombine uyaranlara olmanın (2 EF güçlü x 4 kimyasal konsantrasyonları) 21 ile hücreleri sağlamak için bir PMMA esaslı çok kanallı-çift-elektrik alan çip fabrikasyon. ayrıca boyunca artırmak ve kayma gerilmesi uyaran eklemek için, biz tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında hücresel yanıtları incelemek için iki PMMA esaslı mikroakışkan cihazlar geliştirdi. Lo ve ark. 22,23 tarafından bildirilen bu cihazlar in vivo dolaşım sistemini taklit eden sürekli akışkan akan tabi beş bağımsız hücre kültürü kanalları içerir. birinci çip (kimyasal kayma gerilimi çip veya CSS çip) beş göre 0 konsantrasyonları, 1/8, 1/2, 7/8 ve 1, kültür bölgelerinde üretilen ve bir kesme stresi gradyanı edilir süredenBeş kültür alanlarının her birinin içine ced. ikinci çip elektrot tek bir seti ve 2 şırınga pompaları kullanılarak (kimyasal-elektrik alan çip ve CEF çip) olmak üzere beş EF güçlü, bu kültür alanları içinde beş farklı kimyasal konsantrasyonlar ilave olarak oluşturulur. Sayısal hesaplamalar ve simülasyonlar daha iyi bir tasarım uygulandı ve bu yongaları işletmek ve bu cihazların içinde kültüre akciğer kanseri hücreleri reaktif oksijen türlerinin üretimi ile ilgili yanıtları gözlemlemek için tek veya eşlik eden uyaranlara (ROS) tabidir, göç oranı, ve göç yönü. Bu çipler zaman tasarrufu hücreleri çeşitli mikro-çevresel uyaranlara nasıl tepki araştırmak için, yüksek verim ve güvenilir cihazlar olduğu gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>detach cell from the dish</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>10 cm cell culture Petri dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Bright-Line&amp;nbsp;Hemacytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td>Cell Counting Equipment</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Customized</td><td>Customized</td><td>Microfluidic chip</td></tr><tr><td>Adaptor</td><td>Customized</td><td>Customized</td><td>Microfluidic chip</td></tr><tr><td>0.07/0.22 mm double-sided tape&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>Microfluidic chip</td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>Salt bridge</td></tr><tr><td>2&#039;-7&#039;-dichlorodihydrofluoresce diacetate</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Intracellular ROS measurement</td></tr><tr><td>Indium tin oxide (ITO) glass</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Heater</td></tr><tr><td>Proportional-integral-derivative controller&amp;nbsp;</td><td>JETEC Electronics Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Temperature controller</td></tr><tr><td>Thermal coupler</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>Temperature controller</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; laser scriber</td><td>Laser Tools &amp;amp; Technics Corp.</td><td>ILS2</td><td>Microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Syringe pumps</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>Pumping medium and chemicals into the chip</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Major Science&amp;nbsp;</td><td>MP-300V</td><td>Supplying direct currents</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Monitoring cell migration</td></tr><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>Monitoring cell migartion and fluorescencent signals</td></tr><tr><td>DSLR camera</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>Recording bright-field images&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>Recording fluorescent images&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>super glue</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>Attaching adaptors to PMMA substrates</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Designing microfluidic chips</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Dissolving DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Quantifying fluorescent intensities and cell migration</td></tr></tbody></table>

designing microfluidic devices for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli

Mikroakışkan cihazlar pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, ve diğer fiziksel ya da kimyasal uyarılara bir hassas ve kontrollü hücresel mikro çevrede oluşturma yeteneğine sahiptir. Bunlar genellikle çevresi gibi in vivo sağlayarak in vitro hücre çalışmaları için kullanılmıştır. bu olayların hücresel özellikleri ve işlevleri anlamada önemli olduğundan özellikle hücreleri kimyasal geçişlerini, elektrik alanlar ve kayma gerilmeleri cevabını kaç ilgi çekmiştir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan (PDMS) polimer, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polietilentereftalat (PET) alt tabakaların yapılabilir. Bu malzemelerin dışında, PMMA substratlar ucuz ve kolay bir şekilde lazerle ablasyonu ve yazma kullanılarak işlenebilir. Birkaç mikroakışkan cihazları, birden üreten kimyasal ve elektrik uyarılarının eşlik için tasarlanmış ve imal edilmiş olmasına rağmen, bunların hiçbiri kabul edildiYeterince tarama amacıyla özellikle deneysel tekrarlar, azaltılmasında etkili. Bu yazıda, tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve göç, hücresel yanıtları araştırmak için iki PMMA esaslı mikroakışkan cips bizim tasarım ve imalat açıklar. İlk çip beş göreli konsantrasyonları üretir 0, 1/8, birlikte bu alanların her birinde içinde üretilen bir kayma gerilmesi gradyan ile kültür bölgelerinde 1/2, 7/8, ve 1. İkinci çip ancak her kültür alanı içinde oluşturulan beş farklı elektrik alan güçlü olan, aynı bağıl konsantrasyonlarını oluşturur. Bu cihazlar sadece hassas, kontrollü mikro-çevre hücreleri sağlamak değil, aynı zamanda büyük ölçüde deneysel verimi arttırmak değil.

Kimyasal kayma gerilme (CSS) Çip CSS çip, iki çift taraflı bantlar ile birlikte bağlı üç PMMA levhalar, kalınlık 1 mm, her biri, kalınlığı 0.07 mm (Şekil 1A ve 1B) her biri yapılır. &quot;Noel ağacı&quot; yapısı 0 beş nispi konsantrasyonları üretir 1/8, beş kültür alanlarında 1/2, 7/8, ve 1. hacim akış hızını, akışkan viskozitesi ve akışkan kanalın boyutu ...

Watch this Scientific Journal Video about Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli at JoVE.com

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

designing-microfluidic-devices-for-studying-cellular-responses-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K Görüntüleme.  National Taiwan University. Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Video: Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biyoloji

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood flow triggers a signaling cascade resulting in vasodilation thereby alleviating mechanical stress on the vascular wall. The pattern of shear stress is also well known to be a critical factor in the development of atherosclerosis with laminar shear stress being atheroprotective and disturbed shear stress being pro-atherogenic. While we have a detailed understanding of the various intermediate cell signaling pathways, the receptors that first translate the mechanical stimulus into chemical mediators are not completely understood. Mechanosensitive ion channels are critical to the response to shear and regulate shear-induced cell signaling thereby controlling the production of vasoactive mediators. These channels are among the earliest activated signaling components to shear and have been linked to shear-induced vasodilation through promoting nitric oxide production (e.g., inwardly rectifying K+ [Kir] and transient receptor potential [TRP] channels) and endothelium hyperpolarizing factor (e.g., Kir and calcium-activated K+ [KCa] channels) and shear-induced vasoconstriction through an undetermined mechanism that involves piezo channels. Understanding the biophysical mechanism by which these channels are activated by shear forces (i.e., directly or through a primary mechano-receptor) could provide potential new targets to resolve the pathophysiology associated with endothelial dysfunction and atherogenesis. It is still a major challenge to record flow-induced activation of ion channels in real time using electrophysiology. The standard methods to expose cells to well-defined shear stress, such as the cone and plate rheometer and closed parallel plate flow chamber do not allow real time study of ion channel activation. The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber that allows real time electrophysiological recording of mechanosensitive ion channels under well-defined shear stress.

The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber for use in investigating real time activation of mechanosensitive ion channels by shear stress.

Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...