Bu yöntem DNA iplikçik değişimindeki adımların deşifre edilmesine yardımcı olabilir ve onarım sırasında kombinasyonda yer alan farklı proteinlerin molekül rollerini ortaya koymaktadır. Bu teknikle DNA iplikçik değişimini reaksiyonda herhangi bir bozulma olmadan gerçek zamanlı olarak izleyebilir ve her reaksiyon adımının kinetiklerini belirlemek için ameliyathaneyi kullanabiliriz. Bazı küçük ayarlamalarla, bu teknik memeliler ve bitkiler gibi diğer türlerden elde edilen saflaştırılmış rekombinasyon proteinlerinin faaliyetlerini incelemek için uygulanabilir.
Prosedürü gösteren Kentaro Ito, benim laboratuvar bir Post Doc olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre tepki arabelleği A'yı hazırlayın. Daha sonra, DNA eşleştirme testi için tampon36-nanomole 16FA-oligonükleotid ekleyin.
Karışımı 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın. Rad-51 proteinini karışıma 1,5 mikro benlik son konsantrasyonunda ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Karışıma 0,15 mikro benlik son konsantrasyonunda SWI5-SFR1 proteinini ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika daha kuluçkaya yatırın.
1.0 ile 1.0 cm kuvars cuvette manyetik karıştırıcı içeren karışımın 1,5 mililitre aktarımı. Bir spektroflorometre içine cuvette yerleştirin ve sıcaklık denetleyicisi ve manyetik karıştırıcı ayarlamaya devam edin. FAM floresan emisyon değişikliğini 525 nanometrede, uyarma üzerine 493 nanometrede bir saniye aralıklarla 100 saniye boyunca kaydedin.
Son olarak, bir şırınga ile, cuvette içine 36 nano benler son konsantrasyonda ROX etiketli çift iplikli DNA enjekte. Floresan emisyondaki değişikliği 30 dakika boyunca bir saniye aralıklarla kaydedin. Yüzeyler ve son ürünler arasındaki floresan spektrumları karşılaştırmak için RAD-51 içeren 16 FA-oligonükleotiti içeren her bir cuvette'yi bir spektroflorometreye ve inkübatöre 5 dakika boyunca 37 derece santigrat derecede yerleştirin.
Daha sonra, 493 nanometre de uyarma üzerine 500 ila 600 nano metre FAM floresan emisyon kaydedin. RAD-51'in floresan spektrumları üzerindeki etkisini test etmek için RAD-51'i 1,5 mikro benlikson konsantrasyonunda ekleyin. Ve karışımı 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.
Son olarak, 493 nanometre de uyarma üzerine 500 ila 600 nanometre floresan spektrum kaydedin. Tüm tek iplikli DNA substratı eşleştirme testinde çift iplikli DNA'ya dönüştürüldüğünde, maksimum FRET verimi floresan şiddetinde maksimum azalma ölçülerek elde edilir. Ya da tüm çift iplikli DNA substratı yer değiştirme testinde tek iplikli DNA'ya dönüştürüldüğünde yoğunluktaki maksimum artışı ölçerek.
Her iki tahlilde de RAD-51 proteininin eklenmesi FAM floresan salınımını veya kayaçların söndürme verimliliğini etkilemedi. Substrat DAA'ları ile sonraki fotoğraf beyazlatma arasındaki spontan reaksiyonların etkileri küçüktür. RAD-51 olmadan FAM emisyonunda ihmal edilebilir değişiklikler gösterildiği gibi, RAD-51 ile görülen önemli değişiklikler ile karşılaştırıldığında.
SWI5-SFR1 kompleksinin eklenmesi RAD-51'in eşleştirme etkinliğini güçlü bir şekilde uyarır. Eşleştirme reaksiyonu, ilk üç iplikli ara nın oluşumu, ikinci ara ara ile geçiş ve tek iplikli DNA'nın serbest bırakılması ve hetero dubleks oluşumundan oluşan üç aşamalı bir model kullanılarak simüle edilir. Üç adımlı modelin iki adımlı bir modelle karşılaştırılması, üç adım modelinin SWI5-SFR1 kompleksi olmadan veya swi5-SFR1 kompleksi olmadan veya ile DNA eşleştirmesini simüle etmek için daha uygun olduğunu gösterir.
SWI5-SFR1 ile veya SWI5-SFR1 olmadan her reaksiyon adımının hesaplanan denge sabiti, SWI5-SFR1 kompleksinin ilk üç iplikli ara ipliğin oluşumunu uyarmadığını, ancak iki üç iplikli ara madde ile SS DNA'sının salınımını güçlü bir şekilde uyardığını gösterir. Saflaştırılmış proteinher toplu nükleaz ve helicase kontaminasyon ücretsiz olduğunu doğrulamak için gereklidir.
