Bu eser Grant 31003A-162643 tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Nicole Beuret ve Biozentrum Imaging Core tesisi (IMCF) destek için teşekkür ederiz.

1. Functionalized Nanobodies ile bakteriyel dönüştürme
Not: Bu iletişim kuralı yukarıda açıklanan30ifade, arıtma ve functionalized anti-GFP nanobodies analizi için optimize edilmiştir. Derivatization diğer protein moieties ile bu standart protokol değişikliği gerektirebilir.
<ol><li>Chemocompetent bakteri (~ 100 µL) protein ifade için uygun çözülme (örneğin, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) hücreleri) buz yerleştirerek. Not: Chemocompetent standart laboratuvar yordamlara göre bakteri hücreleri hazırlayın. Alternatif olarak, kimyasal olarak yetkili bakteri hücreleri ticari olarak satın alınabilir.</li>
	<li>50 ekleyin functionalized nanobodies kodlama bir plazmid ng. Yeterli siteye özgü biotinylation bir nanobody muhabir sırasında bakteriyel ifade izin vermek için Ayrıca üç aşamalı bir aşırı ekleyin (150 ng), biotin ligaz BirA kodlama bir bakteriyel ifade plazmid (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ). Yavaşça damlalıklı yukarı ve aşağı. Not: Eğer nanobody biotinylation gerekli değildir veya nanobody gazetecilere bir biotin alıcısı peptid (BAP) yoksun bir plazmid BirA kodlama ile ortak dönüştürme gerekli değildir.</li>
	<li>Bakteriyel hücreler buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Isı şok bakteri hücreleri bir su banyosu veya Isıtma blok 42 ° C'de 1 dk. için koyarak.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) 1 mL ekleyin Luria suyu (LB) orta ve 1 h 37 ° C'de direnç genleri fenotipik ifade izin vermek için bir thermoshaker dönüştürülen bakterilerde kuluçkaya. 1 L LB hazırlamak için orta, denge 5 g maya özü, 10 g tryptone ve 10 g NaCl, su ile doldurun ve ısıyla tarafından sterilize. Functionalized nanobody direnç Ampisilin/carbenicillin içeren bir ifade vektör subcloned adım 1.5 atlanabilir.</li>
	<li>Bakteri 11.000 x g 1 dk. için de cips ve taze LB orta 100 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Askıya alınan bakteri (örneğin, ile 50 µg/mL sefaloridin ve bakteri (yukarıdaki adım 1.2) belirtildiği gibi nanobody muhabir ve BirA ile birlikte dönüştürülmüş zaman 50 µg/mL carbenicillin) anılan sıraya göre antibiyotik içeren LB plakalar üzerinde plaka.</li>
	<li>Kuluçka 37 ° C'de LB tabak yerleştirin ve büyümeye izin gecelik (O/N). Not: Protokol burada 4 ° C'de yetişkin kolonileri LB plakalı depolayarak duraklatılmış Parafilm LB plakalarının için kullanın.</li>
</ol>2. bakteriyel sıvı kültür ve indüksiyon Functionalized Nanobody ifade
<ol><li>Vektör plaka dan ilgi içeren bir bakteriyel koloni almak ve antibiyotik O/N 37 ° C'de titreyen bir kuluçka takıma LB orta 20 mL içeren bir balonun içinde büyümesine izin (Ayrıca bkz: adım 1.7 seçimi antibiyotik ile ilgili).</li>
	<li>Ertesi gün, Yetişkin 20 mL bakteri kültürü 1 L LB orta seçim antibiyotik içeren bir şişesi içine oranında seyreltin.</li>
	<li>0.6-0.7 OD600 ulaşıncaya kadar 37 ° C'de bakteri kültürü kuluçkaya devam'i tıklatın. Kültür protein ifade inducing önce RT için soğumasını sağlar.</li>
	<li>Functionalized nanobodies ve BirA protein ifadesi 1 M izopropil-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) son bir konsantrasyon uyarıcı (1:1, 000 seyreltme) 1 mm için 1 mL eklenmesiyle neden. Ayrıca 10 mL 200 µM d-biotin BAP epitope functionalized nanobodies (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ) mevcut biotinylation izin vermek için büyüme orta sonuçlanan bir 20 mM d-biotin stok çözeltisi ekleyin Not: D-biotin hisse senedi çözüm GKD2içinde O hazırlanır ve drop-wise buna ek olarak 500 mM NaH2PO4tarafından çözümü haline getirdi. Alternatif olarak, d-biotin de DMSO içinde çözülmüş. APEX2 için erimiş nanobodies üretmek için (VHH-APEX2), LB orta ayrıca heme birleşme tanıtmak için 1 mM 5-Aminolevulinik asit (dALA) hidroklorür ile tamamlanabilir gerekir. dALA GKD2O. bir 100 mM hisse senedi çözüm olarak hazırlanır</li>
	<li>1 L IPTG kaynaklı bakteri kültürü için VHH-2xTS için 4 h 30 ° C'de, 20 ° C veya RT O/N için VHH-APEX2 veya 16 kuluçkaya ° C O/N için VHH-mCherry (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ). Not: Yeni bir nanobody yapı için ifade koşullar tarafından deneyci optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Bakteriyel kültür balonun bir 1 L Santrifüjü şişe içine aktarmak ve hücreleri 5000 x g 45 dk. Decant süpernatant için 4 ° C'de de cips ve arıtma ile devam edin. Not: Protokol burada-80 ° C'de bakteriyel Pelet süresiz olarak depolayarak duraklatılmış. VHH-APEX2 veya VHH-mCherry için Pelet genellikle kahverengi (nedeniyle eklenen heme) ya da pembe, sırasıyla.</li>
</ol>3. Functionalized Nanobodies arıtma
<ol><li>Gerekirse, buzda donmuş bakteriyel Pelet çözülme (Ayrıca bkz: adım 2.6).</li>
	<li>Buz gibi bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) 30 mL bakteri hücre Pelet ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Resuspended bakteri etiketli 50 mL tüp içine aktarın.</li>
	<li>30 mL bağlama arabellek ile 200 µg/mL lizozim, 20 µg/mL Dnaz ben, 1 mM MgCl2 ve 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ve RT, 10 min için ilk ve sonra bitti sıra shaker üzerinde 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya ek.</li>
	<li>Mekanik bir ipucu sonicator süspansiyon yerleştirerek 50 mL tüp bakteri hücreleri parçalayıcı. Sabit 3 x 1 dk darbeleri ile 1dk soğutma dönemleri arasında geçerlidir.</li>
	<li>15.000 x g için enkaz ve sağlam hücreleri cips 45 dk 4 ° c de lysate bakteriyel santrifüj kapasitesi. Sonicated bakteri hücre lysate ya Santrifüjü için uygun aralıklarla şişe içine aktarmak veya birkaç 5 mL tüpler için masa üstü Santrifüjü lysate bölün.</li>
	<li>Süpernatant yeni 50 mL tüp içine aktarmak ve pelleted enkaz atın.</li>
	<li>Temizlenen depolamak arıtma immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından hazırlanırken buzda lysate. Functionalized nanobodies histidin öğesini izole etmek için istihdam tek kullanımlık (bkz. Tablo reçetesi) onun sütunları hızlı ve basit yerçekimi akış arıtma izin. Not: Alternatif olarak, toplu iş arıtma ticari sütunlar yerine de kullanılabilir.</li>
	<li>
Onun sütun bir Metal stand montaj.
	<ol>
<li>Sütunları depolama çözümü konik ve onun equilibrate sütun bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) 10 mL ile.</li>
		<li>Yerçekimi akımını (akış yoluyla atılır) boş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaş yavaş temizlenen bakteriyel lysate (~ 30 mL) sütuna yerleştirin. Yerçekimi akımını (akış yoluyla atılır) boş.</li>
	<li>Onun yıkama sütun 2 x 10 mL bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) ile.</li>
	<li>Nanobodies 2 mL elüsyon arabelleği (1 x PBS 500 mM imidazole) ile 2 mL tüp içine elute ve bir arabellek değişimi uygulayın.</li>
	<li>
Arabellek Exchange.
	<ol>
<li>Bir desalting equilibrate sütun bir 50 mL tüp sütun bağdaştırıcısıyla 5 kere 5 mL 1 x PBS de yerleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Arabellek Paketli yatağa girmek izin. Akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>Beşinci PBS denge sonra 1000 x g 2 min için adresindeki sütun spin.</li>
		<li>Akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>Sütun yeni bir 50 mL tüp üzerine bağdaştırıcısıyla yerleştirin. (Kimden adım 3.11) eluted functionalized nanobody desalting sütun PBS equilibrated ve 1000 x g 2 min için spin üzerine 2 mL yük ve eluate toplamak. Not: Ticari desalting sütunları yerine, diyaliz arabellek oluşturma değişimi için uygulanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bicinchoninic (BCA) veya üreticinin yönergelerine göre Bradford tahlil kullanarak eluate protein (nanobody) konsantrasyonu belirlemek. Not: 2-10 mg/mL stok bir konsantrasyon GFP muhabiri hücre hatları ile nanobody alımını deneyleri için idealdir.</li>
</ol>4. doğrulama Functionalized Nanobody ifade (Coomassie boyama)
<ol><li>10-%12,5 jelleri Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) standart protokolleri göre hazırlayın. Not: Alternatif olarak, piyasada bulunan prekast degrade jelleri kullanın.</li>
	<li>Saf functionalized nanobody 1,5 mL tüp ve örnek arabelleği 95 ° c 5 min için kaynatın içine damlalıklı 20 µg. Not: Örneğin, bir 2 mg/mL nanobody hisse senedi çözüm 10 µL 10 µL 2 x örnek arabelleği ile 1,5 mL tüp içine ekleyin. Birim çok küçük ise, daha fazla örnek arabellek eklemeden önce PBS nanobody sulandırmak.</li>
	<li>Örnek arabelleği bir SDS-polyacrylamide jel üzerine haşlanmış arıtılmış nanobody yüklemek ve başvuru boya (örneğin, mavi bromophenol) ayıran jel Coomassie boyama tarafından takip, sonuna ulaşmıştır kadar standart sayfa protokole göre çalıştırmak ve destaining.</li>
	<li>
Coomassie boyama ve Destaining jel.
	<ol>
<li>Jel uncast ve Coomassie boyama çözüm (10 g/L Coomassie hisse senedi % 10 Asetik asit ve % 45 metanol GKD2O çözümde % 5) 20-30 dk RT az hareketli bir sallayarak platform üzerinde leke. Jel tamamen boyama çözümde örtülmelidir.</li>
		<li>Jel destain 2 - 3 kez ile çözüm (% 7.5 Asetik asit ve % 15 metanol GKD2O) için 1 h her RT, jel O/N daha fazla destaining için terk etmeden önce destain. Not: Aşırı Coomassie verimli bir şekilde mutfak kağıt havlu jel çevresinde yerleştirerek batırılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel bir Imager veya seçtiğiniz kamera ile görüntü. Not: Nanobody ifade daha fazla (Ayrıca bkz: şekil 1A) onun epitopları hedefleme antikorlar immunoblot analizi tarafından doğrulanabilir.</li>
</ol>5. Functionalized Nanobodies floresan boyama için kültürlü hücreleri tarafından alımını
<ol><li>Bir hücre kültür başlık, tohum ~ 400.000 için 500.000 HeLa hücreleri stabil bir muhabir GFP öğesini protein 18 mm cam coverslips (No 1.5 H) 35 mm yemekleri veya 6-şey kümeleri üzerinde antibiyotikler (Dulbecco'nın modifiye kartal orta, DMEM içeren tam orta ile ifade etme 100 adet/mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1,5 µg/mL puromisindir ile % 10 fetal buzağı serum (FCS)). Not: Burada, stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP örnek amacıyla ifade HeLa hücreleri kullanırız. İstikrarlı hücre hatları dışında Ayrıca geçici transfected HeLa hücreleri kullanılabilir. İstikrarlı hücre hatları ile ebeveyn sigara transduced HeLa hücreleri, doğrudan karşılaştırma için bu adımda ortak ekili olabilir.</li>
	<li>O/N hücrelerin prolifere için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Hücreleri bir confluency ~ %80 ertesi gün olmalıdır.</li>
	<li>Damlalıklı 2 µL 2 mg/mL nanobody hisse senedi çözüm tam orta 2 mL içeren bir 15-50 mL tüp içine (Bu birim bir 35 mm yemeği veya bir şey, bir 6-şey kümesinin kapağı, orta ve nanobody orantılı olarak daha fazla hücre kültür d eklemek seviyesini ayarlamak için yeterli değil ishes veya kümeleri). Not: Gösterim amacıyla, biz burada kullanmak VHH-mCherry, yok daha fazla antikor boyama nanobody ( şekil 2Cbakınız) EGFP gazeteciler tarafından içselleştirilmiş görmek için gerekli olduğundan.</li>
	<li>Büyüme orta hücrelerdeki kaldırmak ve 35 mm çanak veya 6-de birim başına 2 µg/mL functionalized nanobody içeren prewarmed tam orta 2 mL ekleyin.</li>
	<li>Muhabir-aracılı nanobody alımını sağlamak için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya. Not: Bağlı olarak planlanan deneme, zaman nanobody Alım ayarlanması gerekiyor. Burada gösterilen deneme için 1 h kararlı durum nanobody Alım EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP ulaşmak yeterlidir.</li>
	<li>Orta kaldırmak ve bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 2 - 3 kez yıkamak</li>
	<li>% 3 paraformaldehyde (PFA) 10 dk RT. az için 1 mL ile hücreleri tamir</li>
	<li>İngiltere'de yılın çözümü kaldırmak ve 50 mM NH4Cl 1 x PBS RT., 5 min için 1 mL ile kalan sabitleştirici gidermek Not: %3 PFA ayrı ayrı olarak sabitleştirici kaybı atılmalıdır.</li>
	<li>Bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 3 kez yıkamak</li>
	<li>1 mL %0.1 hücrelerle permeabilize Triton X-100 1 x PBS RT., 10 dk içinde Not: Hiçbir permeabilization gerekli olmasına rağmen daha sonra hücrelerin montaj ortamda katıştırılmış EGFP ve mCherry floresan iyidir.</li>
	<li>Bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 3 kez yıkamak</li>
	<li>Coverslips üstünde bir damla (~ 100 µL) Forseps ile % 1 BSA RT., 5 min için 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) içeren 1 x PBS içinde yerde</li>
	<li>Coverslips geri çanak/kuyunun içine yerleştirin ve 3 kez ile 1 mL 1 x PBS RT., yıkama</li>
	<li>Cam slayt etiket ve Fluoromount-G. hücrelerle bağlama 3-4 h için karanlıkta sertleşmesine ve cam slaytları lamba koruma altında 4 ° C'de depolama montaj orta izin.</li>
	<li>Görüntü desenleri tercih (örneğin, nokta tarama Confocal dik mikroskop) mikroskop kullanarak boyama.</li>
</ol>6. Functionalized Nanobodies (için Sulfation analiz) kültürlü hücreleri tarafından alımını
<ol><li>Bir hücre kültür başlık, stabil bir muhabir GFP öğesini protein 35 mm yemekler veya tam orta içeren antibiyotik (Dulbecco'nın modifiye kartal orta, % 10 fetal buzağı ile takıma DMEM, 6-şey kümelerinde ifade ~ 400.000 için 500.000 HeLa hücreleri tohum Serum (FCS), 100 adet/mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1,5 µg/mL puromisindir). Not: Yukarıda belirtildiği gibi biz burada HeLa hücreleri stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP örnek amacıyla ifade kullanın. İstikrarlı hücre hatları dışında Ayrıca geçici transfected HeLa kullanılabilir.</li>
	<li>O/N hücrelerin prolifere için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Hücreleri bir confluency ~ %80 ertesi gün olmalıdır.</li>
	<li>Tam orta kaldırmak, 2 kez 1 x PBS RT, yıkayın ve % 7.5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için orta (SFM) sülfat içermeyen hücrelerle açlıktan. Not: SFM kartal dengeli tuzları için 500 mL 10 mL MEM amino asitler (50 x) çözeltisi, 5 mL 5 mL vitamini çözeltisi (100 x) ve 900 µL CaCl2·2H2O L-glutamin (200 mM), de ekleyerek hazırlanır. Bir 0,22 µm filtre ve aliquot üzerinden geçmek.</li>
	<li>Havalandırılmış hood veya radyoaktivite iş için belirlenmiş Bank, SFM sodyum tuzu olarak 0.5 MCI/mL [35S] sülfat içeren orta etiketleme sülfat hazırlayın. Uyarı: Dikkatle radyoaktivite içeren tüm çözümleri ele. Yalnızca belirlenen davlumbaz veya banklar çalışmak. Bütün malzeme (ipuçları, tüpler, tabaklar, vb) veya yıkama arabellekleri radyoaktivite ile temas halinde toplanan ve ayrı ayrı bertaraf gerekiyor. Bunu tüm adımları (adım 6.5-6.20) için de.</li>
	<li>VHH-2xTS 1 x PBS sülfat orta 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon olarak etiketleme içine ekleyin. Not: Denetimi olarak da belirli etiketleme göstermek için VHH-std ya da başka bir nanobody yoksun TS siteleri içerir.</li>
	<li>SFM tarafından 0.7 mL orta içeren 0.5 MCI/mL [35S] sülfat ve 2 µg/mL VHH-2xTS etiketleme sülfatın değiştirin ve radyoaktivite ile iş için belirlenmiş bir % 7.5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya. Not: Bağlı olarak planlanan deney, nanobody sulfation zaman ayarlanması gerekiyor. Buna ek olarak, TGN varış Kinetik belirlemek için etiketleme için farklı zamanlarda (örneğin, için 10 dk, 20 dk, 30 dk, vb.) gerçekleştirilir.</li>
	<li>Etiketleme orta kaldırmak ve bulunduğu hücreleri buz gibi 1 x PBS bir soğutma plaka veya buz üzerinde 2 - 3 kez yıkayın.</li>
	<li>1 mL 2 mM PMSF ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile takıma lizis arabellek (PBS içeren % 1 Triton X-100 ve % 0.5 deoxycholate) ekleyin ve 10-15 dk 4 ° C'de sallanan bir platformda için hücreleri kuluçkaya</li>
	<li>Scrape ve lysate 1,5 mL tüp içine, girdap lysate, transfer ve 10-15 dk 4 ° C'de bir bitti sıra rotator üzerinde yer</li>
	<li>Bir postnuclear hazırlamak, 10.000 x g 4 ° C'de 10 dakika aralıklarla tarafından lysate</li>
	<li>Yeni 1,5 mL tüp kullanarak, bir bulamaç nikel boncuk 1,5 mL tüp içinde 20-30 µL hazırlamak ve bir kez tarafından yavaşça onları 1000 x g 1 dk. için de peletleme 1 x PBS ile yıkayın. Not: Nikel yerine boncuk, (nanobody biotinylated ise) streptavidin boncuk veya protein A boncuk nanobody (T7 - veya HA-etiket) bir epitope karşı bir IgG ile kullanılabilir.</li>
	<li>Postnuclear transfer lysate 1,5 mL tüp içine içeren nikel boncuk ve nanobodies izole bir bitti sıra dönme-e doğru tarih 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Bir aliquot (50-100 µL), postnuclear lysate kaldırın ve SDS örnek arabelleği toplam hücre ilişkili nanobody, GFP muhabir ve denetim yükleme sonraki immunoblot analizi için kaynatın.</li>
	<li>Boncuk 3 kez ile 1 PBS veya lizis tampon x 1000 x g 1 dk. için de hafifçe peletleme tarafından yıkayın. Not: Boncuk daha sıkı yıkanmasında, 20 mM imidazole PBS veya lizis arabellekte dahil edilebilir.</li>
	<li>Dikkatle tüm çamaşır arabellek boncuk kaldırmak, 2 örnek arabellek x 50 µL eklemek ve 95 ° C'de 5 dakika kaynatın</li>
	<li>Her iki yük bir MIDI üstündeki SDS-sayfa jel ve başvuru boya (örneğin, mavi bromophenol) ayıran jel ulaştı kadar standart sayfa protokole göre çalıştırmak % 12.5 haşlanmış. Not: Toplam hücre ilişkili nanobody, GFP muhabir ve denetim yükleniyor Immunoblot analizi da mini bir %12,5 kullanarak gerçekleştirilebilir SDS-sayfa veya prekast degrade jel.</li>
	<li>Ayıran jel RT, 1 h için fiksasyon arabellek (% 10 Asetik asit ve % 45 metanol GKD2O) ~ 30 mL fix, jel üç kez ~ 50 mL deiyonize su ile yıkayın ve jel kurutma için hazırlamak.</li>
	<li>
SDS-sayfa jelleri kurutma.
	<ol>
<li>Dikkatli bir şekilde sabit jel gergin sarılmak filmde yer ve precut filtre kağıdı ile kapağı.</li>
		<li>Filtre kağıdı ile jel kurutma platformu üzerine yerleştirin, vakum kapak yerleştirin ve vakum pompası jeli kurutma için geçiş. 3-5 h için jel kuru.</li>
		<li>Sarılmak film kaldırmak ve bir fosfor ekran ile donatılmış bir autoradiography kaset kurutulmuş jel yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fosfor ekran Imager kullanarak görüntü autoradiograph. Üreticinin yönergeleri izleyin. Not: Sinyal gücünü bağlı olarak, artık bu fosfor ekranlarla maruz jelleri ihtiyaç kurumuş.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Nanobodies protein bağlayıcı iskele geleneksel antikorlar üzerinden pek çok avantajları ile ortaya çıkan bir sınıfı temsil: Bunlar küçük, istikrarlı, monomeric,33,35, yüksek benzeşme ve eksikliği disülfür bağları için seçilen 44 , 45. hücre kültür sistemleri ve gelişim biyolojisi46,47,organizmalard...

Proteinler ve çeşitli hücre içi bölmeleri için hücre yüzeyinden lipidler retrograd Rating membran homeostazı salgı dengelemek için ve bileşenleri anterograd taşıma makineleri1 geri dönüşüm için bakımı için önemlidir , 2. clathrin bağlı veya - bağımsız endositoz ile içselleştirilmesi, protein ve lipit kargo ilk doldurmak erken endosomes daha fazla nerede üzerinden ya plazma zarı için geri dönüşümlü endo lizozomal sistemi boyunca yönlendirildi veya hedeflenen trans-Golgi ağa (TGN). Endosomes ve/veya hücre yüzeyine gelen TGN için geri dönüşüm anterograd transmembran kargo reseptörleri ba * bağlı ve katyon bağımsız mannoz-6-fosfat reseptörleri (CDMPR ve CIMPR) gibi bir dizi fonksiyonel döngüsünün bir parçası olduğunu teslim etmek Yeni sentezlenen lizozomal TGN geç endosomes ve organellerin3,4,5, sortilin ve SorLA6,7ve Wntless (WLS) Wnt ligandlar hücre yüzeyine taşınması için hidrolazlar 8 , 9 , 10 , 11. TGN46 ve onun ilgili izoformlarının12,13,14, tuzaklarına (çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı füzyon faktör eki reseptörleri) geri TGN için alındı diğer proteinler vardır 15 , 16 , 17, amiloid precursor protein (APP)18,19, ilerleyici eklem (ANK) protein20, ATP7A/B veya DMT121,22gibi ve transmembran metal taşıyıcı enzimler Karboksipeptidaz D, furin veya BACE123,24,25gibi işleniyor. Endojen bu proteinler dışında bakteriyel ve bitki toksinler (örneğin, Shiga ve kolera toksini, risin ve abrin) retrotranslocation için ER sitozol26,27ulaşmak için retrograd taşıma makineleri kaçırmak, 28,29.
Doğrudan retrograd trafiğini analiz için biz daha önce etiket ve kargo proteinler hücre yüzeyinden hücre içi bölmeleri30' a takip nanobody tabanlı bir araç geliştirdik. Nanobodies protein bağlayıcı Devegiller ve kıkırdaklı balıklar31,32içinde doğal olarak oluşan homodimeric ağır zinciri yalnızca antikorlar (hcAbs) türetilen yeni bir aile temsil eder. HcAbs değişken ağır zincir etki alanını (VHH) teşkil ve geleneksel antikorlar (örneğin, IgGs) üzerinde pek çok avantajı var: onlar monomeric, küçük (~ 15 kDa), yüksek oranda çözünür, disülfür bağları, yoksun bacterially ifade ve seçilmiş yüksek-benzeşme bağlama33,34,35,36. Bizim nanobody araç çok yönlü ve geniş uygun yapmak için functionalized anti-GFP nanobodies tagged GFP onların hücre dışı/lumenal etki ile yüzey-etiket ve parça proteinlere çalıştırmaya başladık. Nanobodies (APEX2) mCherry, askorbat peroksidaz 2 ile functionalization tarafından37veya tirozin sulfation (TS) dizileri, retrograd taşıma bonafide transmembran kargo proteinlerin sabit ya da-ebilmek var olmak çözümlemek ve hücre görüntüleme, yaşamak elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 ve TPST2) aracılı tirozin sulfation ardından bir değişiklik için trans-Golgi sınırlı olduğundan/TGN, biz doğrudan çalışma taşıma ve Kinetik bu hücre yüzeyinden ilgi proteinlerin Hücre içi Golgi yuvası38,39,40.
Bu yöntemleri makalede, biz functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry ve türevleri) memeli hücreleri30retrograd Ulaştırma analiz etmek için uygulamalar için uygun üretim kolaylığı tanımlamak. Biz esas olarak TS siteyi değiştiren nanobody kullanım için sulfation yuvası hücre yüzeyinden hücre içi trafik analiz odaklanın.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Proteinler ve membran hücre yüzeyinden Golgi ve ötesine taşıma Homeostazı, organel kimlik ve Fizyoloji için esastır. Retrograd protein Rating çalışmaya, biz son zamanlarda hücre yüzeyinden ışınlamaya Golgi kompleksi, ya sabit ve canlı hücre Imaging, elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak analiz etmek için çok yönlü bir nanobody tabanlı araç geliştirdik. Functionalized Anti-yeşil flüoresan protein (GFP) nanobodies mühendislik — küçük, monomeric, yüksek-benzeşme protein bağlayıcı — membran proteinlerinin bir hücre dışı GFP yan ile ilgi ifade hücre hatları için uygulanabilir. Derivatized nanobodies GFP gazetecilere bağlı özellikle içselleştirilmiş ve gazetecilere sıralama güzergah boyunca sırtlama nakletti. Nanobodies retrograd taşıma Floresans mikroskobu tarafından takip etmek ve askorbat peroksidaz 2 elektron tarafından muhabir-nanobody kompleksleri ultrastructural lokalizasyonu araştırmak için (APEX2) ile görüntülemede canlı fluorophores ile functionalized mikroskobu ve Kinetik trans-Golgi ağ (TGN) varış değerlendirmek için tirozin sulfation (TS) motiflerle. Bu yöntembilimsel makalede, biz bacterially hızlı ve functionalized nanobodies arındırmak için genel yordamı anahat. Biz bizim aracı endositik alımı ve kargo proteinler varış TGN analiz etmek için mCherry ve TS modifiye nanobodies kullanarak güçlü kullanımını göstermektedir.

Retrograd protein taşıma çeşitli hücre içi hedeflere araştırmak için biz son zamanlarda etiket ve rekombinant füzyon proteinler hücre yüzey30takip nanobody tabanlı bir anti-GFP aracı kurduk. Burada, biz böyle bakteri üretimi nanobodies derivatized ve endositik alımını Floresans mikroskobu ve immunoblotting yanı sıra TGN varış göre sulfation analizi araştırmak için bunların kullanımı eğitim için kendi uygulama göstermek göstermek. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Golgi için hücre yüzeyinden proteinlerin retrograd taşıma membran homeostazı korumak için önemlidir. Burada, biyokimyasal olarak hücre yüzey Golgi taşıma rekombinant proteinlerin functionalized nanobodies HeLa hücreleri kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Bu yöntem, hücre yüzeyinden hücre içi bölmelere retrograd protein taşımaanaliz etmek için bakteriyel ifade, işlevsel nano-cisimlerin üretimi ve uygulanmasını sağlar. Özellikle Trans-Golgi ağı. Bu tekniğin en büyük avantajı sülfasyon kullanımıdır. DTN bölmesine muhabir nano-vücut kompleksi gelişini değerlendirmek için son derece spesifik, bölümlere ayrılmış ve hassas çeviri sonrası modifikasyon. Yaşam hücresi görüntüleme ve elektron mikroskobu için diğer türev nano-cisimler ile birlikte bu yöntem de hastalık ile ilgili hücre yüzey reseptörlerinin endokrinsüreçlerini incelemek için kullanılabilir. İşlevselleştirilmiş nano-cisimlerin repertoiremiz, kültürlü hücrelerde retrograd taşımayı incelemek üzere tasarlandı. Ancak, bu araçlar çok hücreli organizmalarda da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, plaka ilgi vektöriçeren bir bakteri kolonisi seçin ve antibiyotikler ile desteklenen LB orta 20 mililitre içeren bir şişe aşılamak. 37 gecede kuluçka

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Görüntüleme.  University of Basel. Bu yöntem, hücre yüzeyinden hücre içi bölmelere retrograd protein taşımaanaliz etmek için bakteriyel ifade, işlevsel nano-cisimlerin üretimi ve uygulanmasını sağlar. Özellikle Trans-Golgi ağı. Bu tekniğin en büyük avantajı sülfasyon kullanımıdır. DTN bölmesine muhabir nano-vücut kompleksi gelişini değerlendirmek için son derece spesifik, bölümlere ayrılmış ve hassas çeviri sonrası modifikasyon. Yaşam hücresi görüntüleme ve elektron mikroskobu için di...