SNARE kaçakçılığı kullanarak geri dönüşüm endozomlarını incelemek ve analiz etmek için mikroskopi bazlı tahlil. Bunlar deri melanositler. Hücrelerin içinde gördüğünüz siyah renkli organellere melanozom denir.
Melanozomlar lizozom ile ilgili organeller veya LRO adı verilen bir organel sınıfı olarak bilinir. Geri dönüşüm endozomları erkenden tübüler veziküler organellerdir veya tüm hücre tiplerinde endozomları sıralarlar. Bu organeller, melanositler tarafından üretilen lizozomla ilgili bir organel olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar.
Geri dönüşüm endozomları, oluşumları sırasında melanosit spesifik kargoyu prematüre melanozomlara ulaştırıyor. çeşitli sendromlarda gözlenen geri dönüşüm endozomlarının üretimi cilt, saç ve gözün hiperpigmentasyonundaki hücrelerdir. Bu nedenle, geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini incelemek, bu organellerin normal ve hastalık koşullarındaki işlevini anlamak için yararlıdır.
Bu çalışma, SNARE sözdizimini-13'ün tutuklanmasını kullanarak geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini ölçmeyi amaçlamaktadır. İlk adım, önceden işlenmiş kapak örtülerinde fare melanositlerinin tohumlaşılmasıdır. Cam kapakları Petri kabında bodrum membran matris ortamında kaplayın.
Ve doku kültürü kaputunda 15 dakika kurutun. Kullanmadan önce kapakları 1X PBS ile bir kez yıkayın. Bodrum membran orta kaplamalı kapaklardaki hücreleri% 50 ila 60 yetkinlikte tohumla.
Tam RPMI ortamlarında kaplamalı hücre süspansiyonu için her zaman 200 nanomolar PMA ekleyin. Hücreleri tohumladıktan sonra, CO2 inkübatörde hücre içeren kabı 12 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. İkinci adım, hücrelerin sözdizimi-13 plazmidlerle transfeksiyondur.
DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren uçları kuluçkaya yatırın, beş dakika karıştırın ve tekrarlanan pipetleme olmadan karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her on dakikada bir elinizle tüpe dokunun. Kuluçka sırasında, hücreleri 1X PBS ile iki kez, opti-MEM ile bir kez yıkayın ve ardından hücrelere 1 mil OPTI-MEM ekleyin.
30 dakikalık inkübasyon sonrası, transfeksiyon reaktif DNA karışımını yemeği kapatarak damla gibi hücrelere ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede altı saat kuluçkaya yatır. OPTI-MEM ortamını transfeksiyon reaktifi ile epire edin ve 200 nanomolar PMA ile desteklenmiş eksiksiz RPMI ortamı ekleyin.
Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Üçüncü adım hücrelerin sabitlenmesidir. Aşağıdaki işlemin doku kültürü başlığı dışında yapıldığını lütfen unutmayın.
48 saatlik transfeksiyondan sonra, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve ardından hücreleri 30 dakika boyunca% 3 formaldehit ile sabitleyin. Sabitlemeden sonra, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve kapakları bir sonraki kullanıma kadar 1X PBS'de saklayın. Alternatif olarak, hücreler cam plakalara monte edilebilir veya dört santigrat derecede saklanabilir.
Dördüncü adım hücrelerin immün yetimidir. Nemli bir oda hazırlayın. Parafilm kesim parçasını petri kabındaki fare filtresi kağıdına yerleştirin.
Alüminyum folyo ile örtün. 25 mikrolitre birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Bir ila 200 seyreltmede antikor ekleyin.
Bu çözeltiyi nemli haznedeki parafilme bir damla olarak ekleyin. Kapak kapağını dikps ile dikkatlice kaldırın. Birincil antikor boyama çözeltisinin damlasında ters çevirin ve ardından nemli odanın kapağını kapatın.
Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Benzer şekilde, ikincil antikor çözeltisini bir ila 500 seyreltmede hazırlayın ve nemli haznedeki kapak zarının yanındaki parafilme yerleştirin. Çekirdeği boyamak için, çözeltiye 120, 000 ila 130,000 seyreltmede DAPI ekleyin.
Forseps kullanarak, kapak kapağını birincil antikor çözeltisinden dikkatlice alın ve 1X PBS'de iki kez batırın. Kapak üzerindeki fazla PBS'yi çıkarmak için kağıt mendil üzerindeki kapak kılıfı'na dokunun. Nemli haznedeki ikincil antikor boyama çözeltisine yerleştirin ve çözeltide floresan boyalı antikorların varlığı nedeniyle ışığa maruz bırakmayın.
Kuluçkadan sonra, kapak kapağını ikincil antikor çözeltisinden dikkatlice alın ve ardından 1X PBS'de iki kez batırın. Ayrıca, kapak üzerindeki fazla PBS'yi çıkarmak için kağıt mendil üzerindeki kapak kılıfı'na dokunun. Cam bir kaydırağa 12 mikrolitre görüntüleme reaktifi yerleştirin ve lekeli kapak kapağını montaj reaktifine dikkatlice yerleştirin.
Kağıt mendil üzerindeki cam kaydırağı ters çevirin ve ardından hafifçe bastırın. Ardından, kapak kapağını floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin ve ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin. Altıncı adım, geri dönüşüm endozom lokalize proteinleri ve melanozomlar arasındaki örtüşın nicelemesidir.
Melanozomlarla sözdizimi-13 delta-129 kolokalizasyonunun ölçülmesi. Fare vahşi tip melanositlerinde sözdizimi-13 immünoforezans mikroskopisi, veziküler ve tübüler yapılar olarak lokalize GFP-sözdizimi-13 vahşi tip gösterdi. Ve GFP-sözdizimi-13 delta-129, hücre yüzeyine ek olarak halka benzeri yapıları lokalize eder.
Ayrıca hücre içi halka benzeri GFP-sözdizimi-13 delta-129 parlak alan görüntülü melanozomlarda melanozom proteini TYRP1 ile kolokalizasyon gösterdi. Daha önce de gösterildiği gibi, melanozomlarda aşırı ifade edilmiş GFP-sözdizimi-13 vahşi tip bir kohort gözlenir. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin ve GFP-sözdizimi-13 delta-129'un melanozomlara göreli lokalizasyonunu ölçmek için Fiji yazılımı kullanıldı ve JACOP eklentisi ile analiz yapıldı.
TYRP1 ile GFP-sözdizimi-13 delta-129 arasındaki ölçülen Mander'in örtüşme katsayısı, yani MOC, TYRP1 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla yaklaşık 1,5 kat daha yüksektir. İlginçtir ki, TYRP1 GFP-sözdizimi-13 delta-129 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla 2,9 kat daha yüksek MOC değerleri gösterdi. Bu veriler, GFP-sözdizimi-13 delta-129 melanozomlarının lokalizasyonunun, sabit durumdaki GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla nispeten daha yüksek olduğunu göstermektedir.
Geri dönüşüm endozomlarının sözdizimi-13 vahşi tip lokalizasyonunun nicelleştirilmesi. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinde immünoforezans mikroskopisi bilinen geri dönüşüm endosomal proteini Rab11 ile kolokalizasyon gösterdi. mCherry-Rab11 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi tipi arasındaki MOC, GFP-sözdizimi-13 vahşi tipine sahip mCherry-Rab11'e kıyasla yaklaşık 1,4 kat daha yüksektir.
GFP-sözdizimi-13 vahşi tip pozitif endosomal tübüllerin sayısını ve uzunluğunu ölçmek için, protokol bölümünde açıklandığı gibi Fiji yazılımı kullanılmıştır. mCherry-Rab11 deneylerde pozitif bir kontrol kullanılır. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipi ile trans enfekte olan melanositler, mCherry-Rab11'i ifade eden hücrelere kıyasla hücre başına daha yüksek sayıda tübül gösterdi.
Bununla birlikte, tübüller hem GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin hem de hücrelerde mCherry-Rab11'in birlikte ifadelanmasıyla azalır. Yedinci adım, geri dönüşüm endozomlarının borulu sayısı ve uzunluğunun ölçülmesidir. Tübüller, hücrelerde hem GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin hem de mCherry-Rab11'in birlikte ifadelenmesiyle azalır.
İlginçtir ki, hem GFP-sözdizimi-13 vahşi türünden hem de mCherry-Rab11'den ortalama tübül uzunluğu, ayrı ayrı veya birlikte ifade eden hücrelerde birbiriyle karşılaştırılabilir. Birlikte, bu veriler GFP-sözdizimi-13 vahşi türünün Rab11'e benzer şekilde geri dönüşüm endozomlarına yerelleşerek yerelleştirdiğini göstermektedir. Bu çalışma, GFP-sözdizimi-13 delta-129 olan sözdizimi-13 mutantının N-terminal teslimatının, GFP-sözdizimi-13 delta-129 melanozomlarına lokalize olduğunu, muhtemelen geri dönüşüm endozomlarından hücre yüzeyine ve LRO'ya ve LRO'ya veziküler kaçakçılığın muhabiri olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
Buna karşılık, GFP-sözdizimi-13 vahşi türü, endozomların Rab11'e benzer şekilde geri dönüştürülmesini yerelleştirir. Bu çalışma, GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin melanositlerde geri dönüşüm endozomlarını işaretlemek için de kullanılabileceğini göstermektedir. GFP-sözdizimi-13 vahşi türü, Rab11 endosomal dinamikleri değiştirdiğinden, Rab11'den daha iyi bir geri dönüşüm endosomal işaretleyici olabilir.
GFP-syntaxin-13 vahşi tipi, dinamikleri sabit durum koşullarında incelemek için potansiyel bir geri dönüşüm endosomal işaretleyicisi görevi görür.
